趙云龍，楊衛(wèi)紅，閆　良，魏璐嫚，王　沛， 張　衛(wèi)，曾昭書#，張莉蓉#

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室 鄭州 450001　2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室 鄭州 450001　3)鄭州大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系 鄭州 450001　4)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科 鄭州 450052

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CYP3A4*1G依賴的CYP3A4內(nèi)含子10啟動的真核表達(dá)載體的構(gòu)建*

趙云龍1)，楊衛(wèi)紅1)，閆良2)，魏璐嫚2)，王沛3)， 張衛(wèi)4)，曾昭書1)#，張莉蓉2)#

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室 鄭州 4500012)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室 鄭州 4500013)鄭州大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系 鄭州 4500014)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科 鄭州 450052

關(guān)鍵詞CYP3A4；真核表達(dá)載體；啟動子；內(nèi)含子

摘要目的：構(gòu)建CYP3A4*1G依賴的CYP3A4內(nèi)含子10啟動的真核表達(dá)載體，研究CYP3A4*1G依賴的CYP3A4內(nèi)含子10的啟動子功能。方法：以質(zhì)粒pGEM-CYP3A4為模板擴(kuò)增出CYP3A4 cDNA，PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRV、XbaⅠ雙酶切后插入到pcDNA3.1/Hygro(+)的EcoRV、XbaⅠ雙酶切位點之間，構(gòu)建pcDNA3.1-3A4。分別以人基因組DNA和pGEM-CYP3A4質(zhì)粒DNA為模板，擴(kuò)增出CYP3A4啟動子和CYP3A4內(nèi)含子10全長(野生型和突變型)序列，插入到pcDNA3.1-3A4的MluⅠ、NheⅠ雙酶切位點之間，取代原有的CMV啟動子，構(gòu)建pcDNA3.1-P3A4、pcDNA3.1-W3A4(野生型)和pcDNA3.1-M3A4(突變型)。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞，檢測CYP3A4 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切驗證與測序鑒定，插入片段的序列和方向與預(yù)期完全一致。與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/Hygro(+)的HepG2細(xì)胞比較，pcDNA3.1-P3A4、pcDNA3.1-W3A4、pcDNA3.1-M3A4轉(zhuǎn)染組細(xì)胞CYP3A4 mRNA表達(dá)水平均提高(P<0.05)，但pcDNA3.1-M3A4組表達(dá)水平低于pcDNA3.1-P3A4和pcDNA3.1-W3A4組(P<0.05)。結(jié)論：成功構(gòu)建了CYP3A4*1G依賴的CYP3A4內(nèi)含子10啟動的真核表達(dá)載體；CYP3A4內(nèi)含子10能夠啟動CYP3A4基因的表達(dá)，且存在CYP3A4*1G等位基因依賴性。

Construction of eukaryotic expression vector of CYP3A4 intron 10 promoter regulated by CYP3A4*1G

ZHAOYunlong1),YANGWeihong1),YANLiang2),WEILuman2),WANGPei3),ZHANGWei4),ZENGZhaoshu1),ZHANGLirong2)

1)DepartmentofForensicMedicine,SchoolofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)DepartmentofPharmacology,SchoolofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500013)DepartmentofPharmacology,SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500014)DepartmentofAnesthesiology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsCYP3A4；eukaryotic expression vector；promoter；intron

AbstractAim: To construct CYP3A4 eukaryotic expression vector which promoted by CYP3A4 intron 10 regulated by CYP3A4*1G.Methods: The segment of CYP3A4 cDNA was amplified from plasmid pGEM-CYP3A4 by PCR，and the PCR product was digested withEcoRV andXbaⅠ and ligated into pcDNA3.1/Hygro(+) to obtain vector pcDNA3.1-3A4. The segment of CYP3A4 promoter and that of the full-length of CYP3A4 intron 10 with CYP3A4*1G allele were amplified from human genome DNA and pGEM-CYP3A4,respectively,then were ligated into pcDNA3.1-3A4 between the sites of restriction enzymeMluⅠ andNheⅠ replacing the CMV promoter,to obtain pcDNA-P3A4,pcDNA3.1-W3A4 and pcDNA3.1-M3A4. The vectors were transfected into HepG2, respectively,and the levels of CYP3A4 mRNA were detected by quantitative real-time PCR. Results: These insertion sequences and their directions were exactly correct. The CYP3A4 mRNA level of CYP3A4 promoter transfection group, intron 10 (GG) group, intron 10 (AA) transfection group were all higher compared with empty plasmid transfection group. The CYP3A4 mRNA level of intron 10 (AA) group was lower than those of CYP3A4 promoter group and intron 10 (GG) group (P<0.05).Conclusion: CYP3A4 eukaryotic expression vector promoted by CYP3A4 intron 10 regulated by CYP3A4*1G has been constructed successfully. CYP3A4 intron 10 could promote CYP3A4 mRNA expression, which is regulated by CYP3A4*1G allele.

CYP3A4是CYP3A亞家族中最主要的成員，占P450酶系總量的30%～40%，主要分布在肝臟和腸道。它參與了許多藥物和外源性毒物的氧化代謝，可代謝約50%的臨床常用藥物。研究[1-2]表明，人肝臟中CYP3A4的表達(dá)及其活性存在著明顯的個體差異，并且這種差異90%與遺傳多態(tài)性有關(guān)。CYP3A4*1G(rs2242480)是CYP3A4內(nèi)含子10中的一個單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其等位基因頻率在亞洲和南非人群中超過20%[3-5]。研究[5-10]表明CYP3A4*1G與阿托伐他汀、環(huán)孢霉素、他克莫司、芬太尼等藥物的劑量、療效及藥代動力學(xué)改變有關(guān)。前期體外研究[11]發(fā)現(xiàn)，在HepG2細(xì)胞中CYP3A4內(nèi)含子10具有啟動子活性，并被CYP3A4*1G等位基因依賴性調(diào)控，但CYP3A4*1G調(diào)控的CYP3A4內(nèi)含子10與CYP3A4基因表達(dá)之間的關(guān)系尚不清楚。該研究分別構(gòu)建了由CYP3A4啟動子和CYP3A4*1G依賴的CYP3A4內(nèi)含子10啟動的CYP3A4真核表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞，檢測CYP3A4 mRNA的表達(dá)情況。

1材料與方法

1.1材料pcDNA3.1/Hygro(+)空質(zhì)粒、pGEM-CYP3A4為浙江大學(xué)藥學(xué)院藥物分析與藥物代謝研究室曾蘇教授惠贈。攜帶CYP3A4*1G(GG/AA)的基因組DNA來自河南漢族健康志愿者，由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室保存。質(zhì)粒小提試劑盒(Axygen公司)，膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司)，限制性內(nèi)切酶(NEB公司)，T4 DNA連接酶(TaKaRa公司)，PrimeSTAR?Max DNA 聚合酶、感受態(tài)DH5α和反轉(zhuǎn)錄試劑；TriPure Isolation試劑(羅氏公司)；SYBR SELECT MASTER MIX(Life公司)、Invitrogen lip2000。PCR引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。儀器設(shè)備主要有超凈工作臺、PCR擴(kuò)增儀、NanoDrop 2000c分光光度計、37 ℃搖床、離心機(jī)、水平電泳儀、ABI 7500Fast實時熒光定量PCR儀等。

1.2質(zhì)粒擴(kuò)增將pcDNA3.1/Hygro(+)空質(zhì)粒、pGEM-CYP3A4質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，使其隨細(xì)胞的繁殖而復(fù)制擴(kuò)增，然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒并測定濃度備用。

1.3目的片段的擴(kuò)增、純化及回收根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中CYP3A4 cDNA(NM_017460.5)設(shè)計引物，在上、下游引物的5’端分別加上EcoRV和XbaⅠ酶切位點和保護(hù)堿基。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中CYP3A4基因(AF280107)5’端上游啟動子區(qū)序列設(shè)計引物，在上、下游引物的5’端分別加上MluⅠ和NheⅠ酶切位點和保護(hù)堿基。根據(jù)CYP3A4基因(AF280107)內(nèi)含子10全長序列設(shè)計引物，在上、下游引物的5’端分別加上MluⅠ和NheⅠ酶切位點和保護(hù)堿基。PCR引物序列見表1。擴(kuò)增CYP3A4 cDNA所用模板為pGEM-CYP3A4質(zhì)粒DNA，擴(kuò)增 CYP3A4啟動子、CYP3A4內(nèi)含子10所用模板為人類基因組DNA。PCR反應(yīng)體系：PrimeSTAR?Max DNA聚合酶(2×) 25 μL，上、下游引物各3 μL，模板DNA 4 μL，超純水補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)條件為98 ℃10 s，65 ℃15 s，72 ℃2 min，30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，按膠回收試劑盒說明書操作，回收目的片段并測濃度。

1.4pcDNA3.1-3A4重組質(zhì)粒的構(gòu)建用EcoRV和XbaⅠ雙酶切空質(zhì)粒pcDNA3.1/Hygro(+)、PCR產(chǎn)物CYP3A4 cDNA片段，純化回收后測DNA濃度，16 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂在含氨芐青霉素 (100 mg/L) 的LB固體培養(yǎng)基上，根據(jù)培養(yǎng)板菌落生長情況挑取單克隆，提取質(zhì)粒DNA，用BamHⅠ進(jìn)行酶切驗證。陽性質(zhì)粒pcDNA3.1-3A4送立菲生物技術(shù)有限公司測序。

1.5CYP3A4啟動子及CYP3A4*1G依賴的CYP3A4內(nèi)含子10啟動的真核表達(dá)載體的構(gòu)建用MluⅠ和NheⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pcDNA3.1-3A4、PCR產(chǎn)物CYP3A4啟動子及內(nèi)含子10 DNA片段，純化回收測DNA濃度，16 ℃連接過夜。然后轉(zhuǎn)化、篩選、提取質(zhì)粒，質(zhì)粒DNA用MluⅠ和NheⅠ雙酶切驗證。陽性質(zhì)粒pcDNA3.1-P3A4(CYP3A4啟動子重組質(zhì)粒)、pcDNA3.1-W3A4(CYP3A4內(nèi)含子10野生型重組質(zhì)粒)和pcDNA3.1-M3A4(CYP3A4內(nèi)含子10突變型重組質(zhì)粒)送立菲生物技術(shù)有限公司測序,測序結(jié)果用DNAMAN軟件與預(yù)期序列比對。載體構(gòu)建示意圖見圖1。

表1　擴(kuò)增目的片段所用引物

F表示上游引物，R表示下游引物，下劃線表示酶切位點。

圖1　載體構(gòu)建流程

1.6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞中CYP3A4 mRNA的檢測

將按1.5方法構(gòu)建的3種質(zhì)粒及空質(zhì)粒pcDNA3.1/Hygro(+)分別轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞，采用實時熒光定量PCR檢測CYP3A4 mRNA的表達(dá)水平。以GAPDH為內(nèi)參，用ΔΔCT法計算CYP3A4 mRNA表達(dá)水平。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，4組間CYP3A4 mRNA表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1構(gòu)建的重組質(zhì)粒的鑒定重組質(zhì)粒pcDNA3.1-3A4的BamHⅠ酶切結(jié)果見圖2，目的條帶介于500 bp與750 bp之間。重組質(zhì)粒pcDNA3.1-P3A4、pcDNA3.1-W3A4、pcDNA3.1-M3A4的MluⅠ和NheⅠ雙酶切結(jié)果見圖3，目的條帶介于1 000 bp與2 000 bp之間。酶切結(jié)果均與預(yù)期片段長度相符。測序結(jié)果顯示均正確。

M：marker;1～3：pcDNA3.1-3A4。圖2　pcDNA3.1-3A4酶切結(jié)果

M：marker;1：pcDNA3.1-P3A4;2：pcDNA3.1-W3A4;3：pcDNA3.1-M3A4。圖3　pcDNA3.1-P3A4、pcDNA3.1-W3A4、pcDNA3.1-M3A4的雙酶切結(jié)果

2.2轉(zhuǎn)染細(xì)胞中CYP3A4 mRNA表達(dá)水平的比較

4種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中CYP3A4 mRNA表達(dá)水平測定結(jié)果見表2。

表2　4組細(xì)胞中CYP3A4 mRNA表達(dá)水平

4組比較，F(xiàn)=15.218，P=0.001；*：與pcDNA3.1/Hygro(+)組相比，P<0.05；#：與pcDNA3.1-P3A4和pcDNA3.1-W3A4組相比，P<0.05。

3討論

啟動子一般位于基因的上游，能夠與RNA聚合酶特異性結(jié)合從而啟動轉(zhuǎn)錄。研究[12]發(fā)現(xiàn)，一個基因的表達(dá)可以同時受多個啟動子調(diào)控，且不同的啟動子轉(zhuǎn)錄效率不同。有研究[13-14]報道一些內(nèi)含子具有啟動子活性，可調(diào)控基因的表達(dá)。該課題組前期通過雙熒光素酶報告基因研究發(fā)現(xiàn)，與藥物代謝密切相關(guān)的CYP3A4基因，除了5’端啟動子外，其內(nèi)含子10也具有啟動子功能，并具有CYP3A4*1G等位基因依賴性[11]?；虻谋磉_(dá)往往受多方面因素的影響，構(gòu)建cDNA重組質(zhì)粒并用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染可以排除其他調(diào)控序列對目的基因表達(dá)的干擾，從而有效地驗證某一DNA片段或SNP對目的基因表達(dá)的影響。有文獻(xiàn)[15]報道將內(nèi)含子嵌入真核表達(dá)載體，可通過測定外源基因的表達(dá)研究其功能。為驗證CYP3A4內(nèi)含子10是否對CYP3A4基因表達(dá)有影響，該研究構(gòu)建了一系列真核表達(dá)載體。

重組質(zhì)粒中的目的片段是否正確連入載體，需要經(jīng)過測序驗證。在測序之前往往先進(jìn)行菌液PCR或酶切初步驗證。菌液PCR在初篩過程中比較方便而且更為經(jīng)濟(jì)，但可能存在非特異性擴(kuò)增，導(dǎo)致假陽性，不如酶切結(jié)果可靠。該研究采用酶切驗證。值得注意的是，由于pcDNA3.1-3A4重組質(zhì)粒構(gòu)建完成后，XbaⅠ酶切位點前方5’端插入了兩個堿基GA，形成了GATC序列，該序列能夠被Dam甲基化酶識別，在腺嘌呤N6位置引入甲基，從而導(dǎo)致酶切受阻形成假陰性。為此，實驗中進(jìn)行BamHⅠ單酶切驗證。由于pcDNA3.1/Hygro(+)空質(zhì)粒與CYP3A4 cDNA各有一個BamHⅠ酶切位點，CYP3A4 cDNA插入EcoRV-XbaⅠ處后，二者相距686 bp，用BamHⅠ酶切后電泳圖上顯示酶切結(jié)果介于500 bp與750 bp之間者為陽性。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果表明，CYP3A4內(nèi)含子10能夠有效地啟動CYP3A4基因的表達(dá)，并存在CYP3A4*1G等位基因依賴性，CYP3A4*1G突變型(AA)啟動子活性低于野生型(GG)。

總之，該研究成功構(gòu)建了由CYP3A4啟動子及CYP3A4*1G依賴的CYP3A4內(nèi)含子10啟動的CYP3A4真核表達(dá)載體，并從細(xì)胞水平進(jìn)一步證實了CYP3A4*1G依賴的內(nèi)含子10可啟動CYP3A4 mRNA的表達(dá)，為CYP3A4內(nèi)含子10及CYP3A4*1G的功能與機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)，為從內(nèi)含子基因調(diào)控角度闡明CYP3A4酶活性的個體差異提供了新的理論依據(jù)。

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中圖分類號R394.6;Q756

#通信作者：張莉蓉，女，1964年10月生，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：藥物基因組學(xué)，E-mail:zhanglirongzzu@126.com；曾昭書，男，1973年5月生，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：法醫(yī)遺傳學(xué)，E-mail:zzs@zzu.edu.cn

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.004

*國家自然科學(xué)基金項目81173127,81171060；河南省杰出青年基金項目074100510020；河南省教育廳基礎(chǔ)研究項目13A310663；河南省

科技廳基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃項目142300410206