方　謙，穆　玉，周　雪，瞿亞男，彭　偉

華北理工大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 唐山 063000

△女，1988年11月生，碩士，醫(yī)師，研究方向：口腔內(nèi)科學(xué)，E-mail:416385376@qq.com

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生物活性玻璃對體外脫礦釉質(zhì)再礦化的影響

方謙△，穆玉，周雪，瞿亞男，彭偉

華北理工大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 唐山 063000

△女，1988年11月生，碩士，醫(yī)師，研究方向：口腔內(nèi)科學(xué)，E-mail:416385376@qq.com

關(guān)鍵詞生物活性玻璃；再礦化；顯微硬度；脫礦釉質(zhì)

摘要目的：觀察生物活性玻璃對早期脫礦釉質(zhì)再礦化的作用。方法：將40塊牛牙釉質(zhì)塊建立人工齲模型后隨機(jī)分為4組：生物活性玻璃組(用質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%生物活性玻璃進(jìn)行再礦化處理)、GC護(hù)牙素組、NaF組(用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%NaF進(jìn)行再礦化處理)和去離子水組。采用pH循環(huán)法進(jìn)行再礦化處理，2次/d，5 min/次，循環(huán)15 d。用顯微硬度儀測量脫礦前、再礦化前及再礦化后牙釉質(zhì)表面的顯微硬度，熒光顯微鏡觀察早期釉質(zhì)齲表層下的熒光帶厚度，測定脫礦深度。結(jié)果：生物活性玻璃組、GC護(hù)牙素組、NaF組再礦化后顯微硬度均較再礦化前增加，且生物活性玻璃組提高幅度最大(P<0.05)。4組再礦化區(qū)熒光帶厚度均較脫礦區(qū)降低(P<0.05)，其中生物活性玻璃組、GC護(hù)牙素組、NaF組均大于去離子水組(P<0.05)。結(jié)論：質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%生物活性玻璃溶液促進(jìn)脫礦釉質(zhì)再礦化的療效較好。

Effect of bioactive glass on demineralization enamel remineralization in vitro

FANGQian,MUYu,ZHOUXue,QUYanan,PENGWei

CollegeofStomatology,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000

Key wordsbioactive glass;remineralization;microhardness；demineralization enamel

AbstractAim: To observe the effect of bioactive glass on the remineralization of demineralization enamel. Methods: Forty bovine teeth were subjected to establish demineralization enamel model, and then were allocated into four groups randomly(10 in each group) and treated with 6% bioactive glass, casein phosphopeptide amorphous calcium phosphate(CPP-ACP),2% sodium fluoride(NaF) and deionized water,respectively.Then they were subjected to the pH-cycling,two times a day and 5 minutes each time, cycling for 15 days for remineralization. The surface microhardness(SMH)of the enamel before demineralization,before and after remineralization were measured by microhardness detector. Thickness of fluorescence beneath the surface of early enamel caries in the demineralization area and the remineralization area were detected by fluorescence microscopy.Results: The SMH after remineralization in bioactive glass,CPP-ACP and NaF groups was higher than those before remineralization, and the change of bioactive glass group was the highest(P<0.05). The thickness of fluorescence in the remineralization area was lower than that in the demineralization area in the four groups(P<0.05), and the demineralization depth of bioactive glass,CPP-ACP and NaF groups was higher than the deionized water group(P<0.05).Conclusion: 6% bioactive glass solution had better effect on remineralization of demineralization enamel.

早期釉質(zhì)齲是指釉質(zhì)表面病變區(qū)失去光澤，呈片塊狀白堊色改變而無實(shí)質(zhì)性缺損。它的治療一般采取非手術(shù)治療，即采用藥物或再礦化等保守方法使齲病病變終止或消除。常用的材料有氟化物、酪蛋白磷酸肽-無定形磷酸鈣(CPP-ACP)、生物活性玻璃及滲透樹脂等，其中氟化物的使用占主導(dǎo)地位，但其安全性仍存在一定的爭議[1]。作者前期已對生物活性玻璃促進(jìn)早期釉質(zhì)齲再礦化的最適濃度進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%的生物活性玻璃溶液再礦化效果較好[2-3]。該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步比較了質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%NaF溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%生物活性玻璃溶液及GC護(hù)牙素(含CPP-ACP)對早期脫礦釉質(zhì)再礦化的效果，為臨床合理用藥提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要材料和儀器質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%生物活性玻璃溶液(45S5)購于北京大清生物技術(shù)有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%NaF溶液(分析純)購于天津市永大化學(xué)試劑有限公司，GC護(hù)牙素(含CPP-ACP)購于日本GC株式會社。人工脫礦液配方：2.2 mmol/L硝酸鈣，2.2 mmol/L磷酸二氫鉀，50 mmol/L冰醋酸，pH值4.5。人工唾液配方(按ISO/TR10271標(biāo)準(zhǔn))：氯化鈉0.4 g，氯化鉀0.4 g，無水氯化鈣0.795 g，磷酸二氫鈉0.78 g，硫化鈉0.005 g，尿素1 g，去離子水稀釋至1 000 mL，pH值7.0。0.1 mmol/L羅丹明B染液購于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，HVST-1000ZA 顯微硬度計(jì)(研潤光機(jī))，BX-53型熒光顯微鏡(日本OLYMPUS)，DH-250型電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京科偉永興儀器有限公司)。

1.2早期釉質(zhì)齲模型的建立選擇新鮮拔除的牛切牙，從中選取釉質(zhì)發(fā)育良好，無脫鈣、無齲壞、無劃痕和裂紋的牛牙40顆，冠根分離，用低速雙面金剛砂片切輪切取20塊5 mm×5 mm×2 mm大小的釉質(zhì)塊(硬度標(biāo)本)和20塊10 mm×8 mm×3 mm大小的釉質(zhì)塊(熒光標(biāo)本)，流水下用600、800、1 000、1 200、2 400目碳化硅砂紙依次拋光唇側(cè)釉質(zhì)面。備用標(biāo)本于4 ℃去離子水中保存?zhèn)溆?。將?biāo)本在37 ℃人工脫礦液中浸泡72 h，可見其釉質(zhì)表面呈白堊色，用去離子水沖洗1 min。脫礦前除釉質(zhì)面外均涂上雙層抗酸指甲油。熒光樣本在釉質(zhì)面一側(cè)涂上雙層抗酸指甲油分為脫礦區(qū)和再礦化區(qū)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組將硬度標(biāo)本和熒光標(biāo)本均隨機(jī)分成4組進(jìn)行再礦化處理：生物活性玻璃組、GC護(hù)牙素組、NaF組和去離子水組，每組5個(gè)標(biāo)本，再礦化處理液分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%生物活性玻璃溶液、GC護(hù)牙素、質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%NaF溶液和去離子水。

1.4再礦化處理將標(biāo)本于脫礦液中浸泡10 min，用再礦化處理液處理5 min，于人工唾液中浸泡8 h，于脫礦液中浸泡10 min，再用再礦化處理液處理5 min×2(早、晚各一次)，于人工唾液中浸泡過夜。循環(huán)15 d，整個(gè)過程在37 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行。浸泡后用去離子水沖洗牙面1 min。

1.5觀測指標(biāo)

1.5.1顯微硬度應(yīng)用顯微硬度計(jì)，于脫礦前、再礦化前及再礦化后測定牙釉質(zhì)表面的顯微硬度，分別記為SMH0、SMH1和SMH2。負(fù)荷1.961 N,作用10 s,每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)測量3個(gè)點(diǎn)，取平均值。計(jì)算顯微硬度差值(ΔSMH=SMH2-SMH1)。

1.5.2再礦化深度再礦化處理結(jié)束后取出標(biāo)本，在脫礦區(qū)和再礦化區(qū)分別切取0.3 mm厚的切片置于載玻片上，吸取0.1 mmol/L新鮮配制的羅丹明B溶液滴于切片表面，以全部覆蓋切片為準(zhǔn)，將載玻片置于濕盒內(nèi)，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)放置1 h。取出切片，用大量去離子水沖洗，干燥后置顯微鏡下(×4)觀察脫礦區(qū)和再礦化區(qū)熒光滲入情況，用Cellsens軟件測量脫礦區(qū)和再礦化區(qū)熒光帶的厚度。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)測3個(gè)點(diǎn)，取平均值，計(jì)算再礦化深度。再礦化深度=脫礦區(qū)深度-再礦化區(qū)深度。

2結(jié)果

2.14組標(biāo)本顯微硬度的比較見表1。再礦化后，生物活性玻璃組、NaF組和GC護(hù)牙素組顯微硬度均較再礦化前顯著提高，去離子水組無明顯變化；生物活性玻璃組顯微硬度提高的幅度ΔSMH最大。

表1　4組SMH測量結(jié)果　HV

*：4組比較，F(xiàn)=35.596，P<0.001；兩兩比較，P均<0.05。

2.24組再礦化深度的比較見圖1、表2。4組再礦化區(qū)熒光帶厚度均低于脫礦區(qū)，生物活性玻璃組、GC護(hù)牙素組、NaF組再礦化深度均大于去離子水組,但這3組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A：脫礦釉質(zhì)；B:生物活性玻璃組；C:NaF組；D:GC護(hù)牙素組；E:去離子水組。圖1　4組脫礦深度觀察結(jié)果 (羅丹明B染色，×4)

組別n脫礦區(qū)再礦化區(qū)再礦化深度*t(P)生物活性玻璃組5111.85±5.3269.47±10.0542.38±15.066.892(<0.001)NaF組5119.08±15.1585.82±20.0933.26±5.82#11.430(<0.001)GC護(hù)牙素組5118.74±16.6884.20±16.9234.53±4.50#13.298(<0.001)去離子水組5125.95±19.04112.73±18.2013.22±2.66#9.938(<0.001)

*：F=6.953，P=0.005；#：與去離子水組比較，P<0.005。

3討論

氟化物作為公認(rèn)的再礦化制劑已大量應(yīng)用于臨床，其防齲機(jī)制體現(xiàn)在以下3個(gè)方面：第一，氟離子可進(jìn)入菌斑內(nèi)，抑制致齲菌的生長和代謝。第二，部分氟離子通過釉質(zhì)中的微孔結(jié)構(gòu)擴(kuò)散、滲透入釉質(zhì)內(nèi)部，取代羥基生成氟磷灰石，從而增強(qiáng)釉質(zhì)的抗酸能力。第三，氟離子能與唾液和釉質(zhì)溶解產(chǎn)生的鈣離子結(jié)合，在釉質(zhì)表層形成氟化鈣沉積層，在以后酸性環(huán)境下能緩慢溶解、釋放氟離子[4]。 雖然氟化物的防治齲效果得到了業(yè)界的公認(rèn)，但仍存在一定的局限性：兒童易誤食；大量使用易導(dǎo)致變異鏈球菌耐氟菌株的產(chǎn)生；氟化物濃度難以長時(shí)間保持穩(wěn)定，需反復(fù)涂擦，且其釋放區(qū)域具有局限性[4-5]。CPP-ACP含高濃度的具有生物活性的鈣磷離子，無毒副作用，通過粘附在牙齒表面釋放鈣磷離子，維持牙體表面鈣磷濃度，緩沖pH值，從而抑制釉質(zhì)脫礦和促進(jìn)再礦化[6-7]，但較氟化物而言，CPP-ACP對于早期齲表面病損的再礦化作用相對較小。因而研發(fā)安全有效的再礦化制劑成為熱點(diǎn)。

生物活性玻璃由SiO2、P2O5、CaO和Na2O等無機(jī)離子構(gòu)成，其活性成分為鈣鈉磷硅酸，具有良好的生物相容性和成骨活性，在口腔領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛，如用于牙周疾病和牙本質(zhì)過敏癥的治療、骨缺損的修復(fù)及促進(jìn)牙體硬組織的再礦化等[8]。Bakry等[9]發(fā)現(xiàn)生物活性玻璃糊劑45S5促進(jìn)脫礦釉質(zhì)再礦化的效果優(yōu)于氟化物凝膠；Mehta等[10]發(fā)現(xiàn)生物活性玻璃再礦化的效果優(yōu)于CPP-ACP。

釉質(zhì)的顯微硬度反映了釉質(zhì)的礦化程度及礦物質(zhì)的得失。牛牙與人牙理化性能的差異導(dǎo)致相同條件下二者的礦物丟失比率不同[11]，因而牛牙釉質(zhì)脫礦后的顯微硬度值較人牙低。不同的釉質(zhì)塊抗酸及再礦化的能力不盡相同，因此該實(shí)驗(yàn)采用顯微硬度差值來評價(jià)生物活性玻璃、NaF和GC護(hù)牙素等3種藥物再礦化的效果，顯微硬度差值越高，說明再礦化能力越好。研究結(jié)果顯示，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%生物活性玻璃溶液處理的釉質(zhì)顯微硬度差值較高，而再礦化深度與其他兩個(gè)藥物組相比無顯著差別，再礦化效果顯著。這可能與生物活性玻璃的防齲機(jī)制及釉質(zhì)表面的鈣磷濃度有關(guān)。生物活性玻璃與唾液接觸后能迅速釋放鈣磷離子，沉積在脫礦釉質(zhì)表面，形成類羥基磷灰石[12]。生物活性玻璃的再礦化機(jī)制除與鈣磷有關(guān)，還可能與硅元素有關(guān)。有學(xué)者[13]發(fā)現(xiàn)硅能夠穩(wěn)定礦物質(zhì)沉積形成的核心，從而加快周圍飽和溶液的再沉積。礦化液中高濃度的鈣離子能夠加快鈣和礦物質(zhì)在釉質(zhì)微孔中的沉積，但影響了鈣離子向深層滲透，而低濃度的鈣離子可滲透到齲損深層而利于礦化[14]。質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%生物活性玻璃溶液及10%CPP-ACP所含的鈣磷離子濃度較高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%NaF溶液所含的氟離子濃度高，在形成氟磷灰石的同時(shí)會形成大量的氟化鈣，從而影響了鈣離子向深層的滲透。

綜上所述，質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%生物活性玻璃溶液促進(jìn)脫礦釉質(zhì)再礦化的療效較好，但其遠(yuǎn)期療效有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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中圖分類號R781.1

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.031