魏金川，徐添翼，吳靜,2，宋曉峰

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真核生物基因組長內(nèi)含子遞歸剪接事件的分子機(jī)制

魏金川1，徐添翼1，吳靜1,2，宋曉峰1

1. 南京航空航天大學(xué)自動化學(xué)院，南京 211106 2. 南京醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與信息學(xué)院，南京 211166

在高等真核生物基因組轉(zhuǎn)錄過程中，一次剪接可完成短內(nèi)含子的去除，而較長內(nèi)含子(>10 kb)則需通過多次剪接方可去除。多次剪接去除長內(nèi)含子的過程通常被稱為遞歸性剪接。已有研究表明，遞歸性剪接事件與諸多生物學(xué)過程及疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。近年來，關(guān)于遞歸性剪接的研究越來越多，研究者已經(jīng)在果蠅()和多種脊椎動物基因組轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)現(xiàn)了遞歸剪接事件，通過不同的生物信息學(xué)方法找到了多個(gè)遞歸剪接位點(diǎn)并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。目前國際上對遞歸性剪接的研究主要集中在遞歸剪接過程、剪接位點(diǎn)識別及其對生物學(xué)過程的影響等方面。本文針對真核生物基因組轉(zhuǎn)錄過程中遞歸剪接事件的分子機(jī)制和國內(nèi)外研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，旨在為深入理解RNA剪接過程分子機(jī)制提供參考。

遞歸剪接；套索結(jié)構(gòu)；RS位點(diǎn)；Total RNA-seq

真核生物基因組轉(zhuǎn)錄過程是以DNA雙鏈中一條鏈為模板，經(jīng)堿基互補(bǔ)配對得到前體mRNA，后通過對內(nèi)含子與外顯子的剪接加工得到成熟的mRNA。內(nèi)含子是基因編碼區(qū)中的非編碼序列，在生物體內(nèi)不編碼蛋白，因此在前體mRNA轉(zhuǎn)錄加工過程中會被剪接體(spliceosome)識別并去除。起初研究者認(rèn)為內(nèi)含子不參與基因的表達(dá)調(diào)控，但近幾年隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展和生物信息學(xué)工具的開發(fā)，人們發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子在轉(zhuǎn)錄及基因表達(dá)調(diào)控中具有重要的生物學(xué)功能，比如：有些內(nèi)含子含有增強(qiáng)子、啟動子或者其他的順式作用元件，對基因的表達(dá)起調(diào)控作用；內(nèi)含子的剪接增加了mRNA的穩(wěn)定性；內(nèi)含子還可能發(fā)生選擇性剪接事件[1~5]。

前體mRNA的剪接過程中，內(nèi)含子通過兩個(gè)外顯子的連接被完全切除，這個(gè)過程需要剪接體介導(dǎo)。前體mRNA的剪接需要兩步實(shí)現(xiàn)：第一步，靠近內(nèi)含子3′端分支位點(diǎn)的A殘基的2′-OH對5′端的磷酸基團(tuán)進(jìn)行親核攻擊，形成2′→5′磷酸二酯鍵連接的套索結(jié)構(gòu)；第二步，被剪接的外顯子3′端核苷酸的-OH進(jìn)攻內(nèi)含子3′末端的磷酸基團(tuán)，使得內(nèi)含子3′端在剪接位點(diǎn)處斷開，釋放套索結(jié)構(gòu)，兩個(gè)外顯子連接[6~8]。此過程是直接去除整個(gè)內(nèi)含子的，屬于一步剪接[9]，但是有一些較長的內(nèi)含子是經(jīng)過了多步剪接來去除的。1999年，Hatton等[10]在黑腹果蠅()基因中發(fā)現(xiàn)，其第1個(gè)內(nèi)含子分3步去除，并將這一剪接過程命名為遞歸剪接(recu-rsive splicing) (圖1)。內(nèi)含子中被剪接的核酸位點(diǎn)稱為遞歸性剪接位點(diǎn)(RS-site)。近年來研究人員發(fā)現(xiàn)，除果蠅以外，遞歸剪接在其他真核生物基因組中也廣泛存在，并與疾病的發(fā)生發(fā)展有重要關(guān)系。本文對真核生物基因組中長內(nèi)含子遞歸剪接分子機(jī)制的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，以期為RNA的剪接研究提供參考，同時(shí)為疾病的診斷和治療提供新的 思路。

圖1 遞歸剪接示意圖

含有兩個(gè)剪接位點(diǎn)的內(nèi)含子分步去除過程。exon1與exon2分別表示兩個(gè)相鄰?fù)怙@子，中間內(nèi)含子有兩個(gè)遞歸剪接位點(diǎn)，灰色箭頭指向剪接位點(diǎn)，一共經(jīng)過了3步拼接在一起。

1 遞歸剪接的特征

1.1 遞歸剪接的過程

通常內(nèi)含子5′端剪接位點(diǎn)被稱為供體位點(diǎn)(donor site)，3′端剪接位點(diǎn)被稱為受體位點(diǎn)(acceptor site)[11,12]。研究表明，內(nèi)含子起始5′端兩對堿基和結(jié)尾3′端的兩對堿基最為保守，在所有的剪接位點(diǎn)中有99.24%的位點(diǎn)為GU-AG，0.7%的位點(diǎn)為GC-AG，0.05%的位點(diǎn)為AT-AC[13]。除了這兩對保守堿基外，它們附近的堿基雖然在不同的物種之間存在差異，但在同一物種中通常具有保守性，如在脊椎動物中5′剪接端堿基通常為AG|GUAAGU[14]。由堿基序列可以看出供體與受體間不存在堿基互補(bǔ)配對的可能，所以它們并不是通過堿基互補(bǔ)的方式拼接到一起的。外顯子轉(zhuǎn)錄是從5′端到3′端進(jìn)行的，遞歸剪接就是把剪接位點(diǎn)處默認(rèn)為含有0個(gè)核苷酸的外顯子，所以遞歸剪接位點(diǎn)通常為AG|GU。

遞歸剪接的具體過程大致如下[15~17]：(1)首先內(nèi)含子3′端上游10~50 bp處的特定腺苷的2′羥基攻擊5′剪接位點(diǎn)(圖2A)，形成5′-2′磷酸二酯鍵，從而構(gòu)成套索結(jié)構(gòu)，進(jìn)而釋放5′外顯子(圖2B)；(2) 5′外顯子的3′羥基攻擊內(nèi)含子3′端最近的遞歸剪接位點(diǎn)(RS sites)，釋放套索結(jié)構(gòu)，與此同時(shí)，5′外顯子的3′-羥基與下游外顯子的5′端連接形成新的磷酸二酯鍵(圖2C)；(3)重復(fù)前面兩個(gè)步驟，直到全部內(nèi)含子去除。

1.2 遞歸剪接位點(diǎn)的特征

針對可變剪接的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子5′和3′端堿基幾乎都是GU和AG，并且內(nèi)含子位點(diǎn)為AGGU的比例高達(dá)99.24%，所以人們對遞歸剪接位點(diǎn)的研究主要也主要針對AGGU型。此外，遞歸剪接在形成套索結(jié)構(gòu)的過程中，在剪接位點(diǎn)上游第5和第6位置處的堿基基本上都為“U”，這也是尋找遞歸剪接位點(diǎn)的主要依據(jù)。而Kelly等[18]研究發(fā)現(xiàn)在人類()全基因組中并非所有遞歸剪接位點(diǎn)都是AGGU，而是AGMN(M、N分別表示A、G、C、U 4種堿基中的一種)，其中AGGN的概率為44%，AGGU的概率僅為14% (表1)。因此，對于非經(jīng)典(剪接位點(diǎn)不是AGGU)遞歸剪接位點(diǎn)的識別已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)問題。

圖2 遞歸剪接套索結(jié)構(gòu)形成與切除示意圖

A：內(nèi)含子3′端上游10~50 bp處的特定腺苷的2′羥基攻擊5′剪接位點(diǎn)；B：構(gòu)成套索結(jié)構(gòu)，釋放5′外顯子；C：釋放套索結(jié)構(gòu)外顯子與遞歸剪接位點(diǎn)相互連接。

表1 遞歸剪接位點(diǎn)AGMN中M、N為各堿基概率統(tǒng)計(jì)表

遞歸性剪接位點(diǎn)AGMN，M與N分別對應(yīng)4種堿基的概率[18]。M/N分別表示剪接位點(diǎn)AGMN中的M/N兩個(gè)堿基；A、C、G、U為4種堿基。

1.3 遞歸剪接位點(diǎn)的識別

Duff等[15]對黑腹果蠅進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，并將得到的Total RNA-seq數(shù)據(jù)用Tophat[19]進(jìn)行了處理。從得到的reads與全基因組匹配結(jié)果中，他們發(fā)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)錄是多個(gè)RNA聚合酶同時(shí)進(jìn)行，所以靠近5′外顯子處的轉(zhuǎn)錄酶更多(圖3A)。存在遞歸剪接現(xiàn)象的內(nèi)含子在reads的分布上存在著波峰與波谷，并且整體呈現(xiàn)鋸齒狀，這種分布模式體現(xiàn)了遞歸剪接去除內(nèi)含子的機(jī)理，其理想的reads密度圖為倒三角狀(圖3B)。遞歸剪接通常存在于大于10 kb的內(nèi)含子中，人類基因組中此類內(nèi)含子較多，長度大于24 kb的內(nèi)含子有8000個(gè)以上；大于50 kb的內(nèi)含子有3400多個(gè)；而超過100 kb的內(nèi)含子都有1200個(gè)以上[20,21]。Sibley等[22]對人腦組織Total RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，從中發(fā)現(xiàn)了8個(gè)遞歸剪接位點(diǎn)，這些位點(diǎn)所在的內(nèi)含子長度都超過150 kb。Duff等[15]用Tophat將果蠅Total RNA-seq數(shù)據(jù)與果蠅全基因組(modENCODE注釋文件)相匹配，發(fā)現(xiàn)含有剪接位點(diǎn)的內(nèi)含子長度都大于2 kb。

近來，遞歸剪接位點(diǎn)的識別主要基于Total RNA-Seq數(shù)據(jù)，輔以對應(yīng)物種的基因組注釋數(shù)據(jù)及基因組序列信息。通常，遞歸剪接位點(diǎn)的識別主要分為以下4步(圖4)：(1) 通過FastQC、Fastx-toolkit分別對其質(zhì)量檢測、控制；(2)利用Tophat進(jìn)行reads映射，得到Bam文件與Junction文件；(3)依據(jù)內(nèi)含子長度、剪接位點(diǎn)保守性對Junction位點(diǎn)進(jìn)行篩選；(4)將Bam文件轉(zhuǎn)換成Sam文件，并與Junction文件相結(jié)合，進(jìn)而通過生物信息學(xué)方法識別遞歸剪接位點(diǎn)。目前，常將周邊reads分布呈鋸齒狀的位點(diǎn)判定為潛在的遞歸剪接位點(diǎn)。

圖3 Total RNA-seq數(shù)據(jù)匹配全基因組統(tǒng)計(jì)得到的結(jié)果圖

A：含遞歸剪接的基因組轉(zhuǎn)錄示意圖。AG/GU為遞歸剪接位點(diǎn)，曲線表示RNA轉(zhuǎn)錄情況，橢圓形表示RNA聚合酶Ⅱ，代表一條DNA鏈在同時(shí)進(jìn)行多次轉(zhuǎn)錄。B：Total RNA-seq的reads密度圖。

圖4 遞歸剪接位點(diǎn)識別流程圖

矩形框中的是數(shù)據(jù)處理過程、用到的文件、得到的結(jié)果等。

2 遞歸剪接研究的進(jìn)展

2.1 果蠅基因組中遞歸剪接的研究

Hatton等[10]于1998年在黑腹果蠅基因中首次發(fā)現(xiàn)了遞歸性剪接現(xiàn)象，在基因的第1個(gè)外顯子和第2個(gè)外顯子之間發(fā)現(xiàn)了新的剪接位點(diǎn)，并且在3′剪接位點(diǎn)的下游的堿基序列為GTAAGA。研究者對基因進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)該基因第1個(gè)內(nèi)含子長73 kb，該內(nèi)含子的去除經(jīng)歷了3次遞歸剪接[24]。

Conklin等[25]于2005年通過套索結(jié)構(gòu)識別遞歸剪接位點(diǎn)，并于基因的第一個(gè)內(nèi)含子中成功識別出Hatton等[10]找到的兩個(gè)遞歸剪接位點(diǎn)。針對套索結(jié)構(gòu)RNA分子半衰期通常較短，且轉(zhuǎn)錄的過程不能準(zhǔn)確把握等問題，他們通過控制PCR技術(shù)對分支連接處2′→5′磷酸二酯鍵的特異性擴(kuò)增，提高了RNA套索結(jié)構(gòu)分析的靈敏度。

2015年，Duff 等[15]以黑腹果蠅為材料，對其進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理，通過二代測序技術(shù)得到對應(yīng)的Total RNA-seq數(shù)據(jù)，然后通過Tophat/Bowtie軟件比對得到Junction位點(diǎn)信息，結(jié)合reads在Junction位點(diǎn)附近的分布信息，最終篩選出197個(gè)潛在的遞歸剪接位點(diǎn)。這些遞歸剪接位點(diǎn)分布于115個(gè)基因的130個(gè)內(nèi)含子中，他們挑選了其中14個(gè)基因用作實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，證實(shí)這些基因含有24個(gè)遞歸剪接位點(diǎn)。對存在遞歸性剪接的基因(115 個(gè))和內(nèi)含子統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，其中有100個(gè)基因只存在一個(gè)遞歸性剪接內(nèi)含子，剩下的15個(gè)基因含有兩個(gè)遞歸性剪接內(nèi)含子。此外，這130個(gè)內(nèi)含子的剪接位點(diǎn)個(gè)數(shù)都在1~6之間。遞歸性剪接內(nèi)含子的堿基長度為11 341~132 736 bp，內(nèi)含子的平均長度為45 164 bp。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，存在遞歸剪接的內(nèi)含子長度都相對較長，但是并不是所有的較長內(nèi)含子都存在遞歸剪接，在較長的內(nèi)含子中只有大約6%存在遞歸性剪接。他們還發(fā)現(xiàn)U2AF蛋白減少會導(dǎo)致含有遞歸剪接的Pre-mRNA加工速率降低。

Pre-mRNA在內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄完成幾秒后就會剪切掉內(nèi)含子，遞歸剪接是內(nèi)含子中間片段的剪接。所以，2018年P(guān)ai等[26]利用4sU對果蠅S2細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，分別獲取轉(zhuǎn)錄5 min、10 min、20 min的Total RNA-seq數(shù)據(jù)，從中發(fā)現(xiàn)了541個(gè)遞歸剪接位點(diǎn)，其中實(shí)驗(yàn)證明的有119個(gè)，這些位點(diǎn)所屬內(nèi)含子長度大部分都超過40 kb。

2.2 脊椎動物基因組中遞歸剪接的研究

除果蠅以外，研究者還對多種脊柱動物進(jìn)行了遞歸剪接的研究，包括人、大鼠()、斑馬魚()等。

2012年，Taggart 等[27]開發(fā)了一個(gè)基于RNA套索結(jié)構(gòu)識別內(nèi)含子3′剪接位點(diǎn)的生物信息學(xué)方法，其假定套索結(jié)構(gòu)都位于3′剪接位點(diǎn)附近。利用該方法，他們對人類12個(gè)組織的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了處理，共篩選出861個(gè)內(nèi)含子3′剪接位點(diǎn)。其中，2118個(gè)reads經(jīng)匹配映射到這些剪接位點(diǎn)附近的套索結(jié)構(gòu)中，而屬于遞歸性剪接套索結(jié)構(gòu)的reads有70個(gè)(3%)。

2015年，Kelly等[18]對基因轉(zhuǎn)錄過程中的內(nèi)含子遞歸剪接事件進(jìn)行了探究?；蛉L221 kb，其中第1個(gè)內(nèi)含子長134 kb。研究人員用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endoth-elial cells, HUVEC)作為實(shí)驗(yàn)材料，利用腫瘤壞死因子(TNFα)對HUVEC進(jìn)行刺激，并通過二代測序技術(shù)(high-throughput sequencing)得到相關(guān)的Total RNA- seq數(shù)據(jù)。接著，將reads匹配到全基因組(hg19)，發(fā)現(xiàn)reads匹配的位置主要分為3類情況：第一類為直接整體匹配到單一外顯子上；第二類匹配到exon-exon上，即分別匹配到上游外顯子的3′ 端部分堿基和下游外顯子的5′端部分堿基；第三類為exon-intron，即一部分匹配到上游外顯子上，而另一部分匹配到相鄰內(nèi)含子的中間部分。其中第三類reads能反映出內(nèi)含子存在遞歸剪接與可變剪接的可能。最后研究者用生物信息學(xué)的方法對套索結(jié)構(gòu)進(jìn)行篩選，從中發(fā)現(xiàn)基因的第1個(gè)內(nèi)含子存在遞歸性剪接現(xiàn)象?；蛟谌四氺o脈內(nèi)皮細(xì)胞中基本不表達(dá)，而TNFα對基因的轉(zhuǎn)錄有著很強(qiáng)的刺激作用，所以研究人員通過熒光原位雜交技術(shù)(fluorescencehybridization, FISH)對基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)較長的內(nèi)含子并不是轉(zhuǎn)錄結(jié)束后直接切除的，而是邊轉(zhuǎn)錄邊剪接的。對于基因的熒光標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，剪切部分的水解時(shí)間占整個(gè)內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄時(shí)間的1/15；它每次剪切大約經(jīng)歷了15 min，其平均半衰期大約為4.2 min。研究表明，在基因遞歸剪接過程中，內(nèi)含子片段的水解過程與形成套索切除的過程是同步進(jìn)行的；在較長的內(nèi)含子中，轉(zhuǎn)錄的速度大約3 kb/min。研究人員使用CRISPR-Cas9技術(shù)[28]對遞歸剪接的分支點(diǎn)(branch point)進(jìn)行突變與刪除，發(fā)現(xiàn)這樣會大大降低Pre-mRNA到成熟mRNA的加工速率。并且，對任意一個(gè)遞歸剪接位點(diǎn)(RS-site)進(jìn)行基因突變或基因敲除處理，基因的表達(dá)量都會降低35%~50%，表明遞歸剪接的分支點(diǎn)和RS位點(diǎn)在對應(yīng)基因的表達(dá)過程中有著重要的作用。同時(shí)研究人員還發(fā)現(xiàn)，在人體靜脈細(xì)胞中含有多個(gè)剪接位點(diǎn)的基因在某一個(gè)剪接位點(diǎn)失效后，會通過下一個(gè)剪接位點(diǎn)或者其他的補(bǔ)償機(jī)制進(jìn)行處理，雖然效率降低，但是還可以表達(dá)[18]。因此，遞歸剪接位點(diǎn)突變后，應(yīng)同樣存在某種補(bǔ)償機(jī)制，使得基因仍能正常轉(zhuǎn)錄。

2015年，Sibley等[22]對脊椎動物神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行了RNA深度測序，分析發(fā)現(xiàn)在脊椎動物神經(jīng)元中存在大量的遞歸剪接現(xiàn)象。由此，他們基于對人類腦組織中遞歸剪接的研究建立了一個(gè)雙重剪接的模型，該模型大體對AGGU為剪接位點(diǎn)的現(xiàn)象進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)遞歸剪接位點(diǎn)上游內(nèi)含子去除后，供體部分的外顯子與剪接后的受體首端的GU相互連接起來，形成新的外顯子-內(nèi)含子-外顯子復(fù)合物，在進(jìn)行下次剪接過程中，有可能本次外顯子-內(nèi)含子會保持連在一起，最終的產(chǎn)物會有兩種，一種是外顯子-外顯子(exon-exon)，另外一種為外顯子-遞歸剪接中間小段內(nèi)含子(exon-intron)這兩種產(chǎn)物。雖然該模型還不夠完善，但也說明了人類細(xì)胞中mRNA亞型具有多樣性。Emmett[29]發(fā)現(xiàn)在人類腦組織中，存在遞歸剪接現(xiàn)象的7個(gè)基因與神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切有關(guān)。

以上研究都是以組織的Total RNA-seq數(shù)據(jù)為材料進(jìn)行分析實(shí)驗(yàn)。2018年Hayashi等[30]開發(fā)了一種對單細(xì)胞Total RNA-seq進(jìn)行測序的方法，即RamDA-seq。與其他方法相比，這種測序方法對non- poly(A) RNA敏感性更高。Hayashi等[30]用RamDA- seq對不同時(shí)期的小鼠胚胎干細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，在長度大于150 kb的內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)了207個(gè)潛在的遞歸剪接位點(diǎn)。2018年P(guān)ai等[31]對果蠅的30 000個(gè)內(nèi)含子進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)存在遞歸剪接的內(nèi)含子也具有半衰期。此外，Srndic 等[32]在人類多個(gè)組織中檢測到12 000個(gè)遞歸剪接事件，并發(fā)現(xiàn)遞歸剪接對無義介導(dǎo)的RNA降解(nonsense-mediated decay)可能起著反作用。

3 遞歸剪接研究的意義

隨著RNA測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的內(nèi)含子被發(fā)現(xiàn)在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，因此對遞歸剪接的深入研究有助于理解內(nèi)含子調(diào)控功能的分子機(jī)制[33]。全基因組研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體可以通過改變RNA聚合酶Ⅱ的合成速度來控制轉(zhuǎn)錄的速率[34]，堿基突變或缺失容易造成各類疾病[35,36]。人類基因組除了必要的編碼信息外，還有許多必要的剪接序列，其內(nèi)部位點(diǎn)的突變或者缺失經(jīng)常會導(dǎo)致疾病的發(fā)生[37~39]。研究人員還發(fā)現(xiàn)在剪接位點(diǎn)發(fā)生突變或者刪除時(shí)，成熟mRNA的生成速率會大大降低。

在人類基因組中，遞歸剪接位點(diǎn)比其他位置更具有保守性，并且廣泛存在[18,22,29,40,41]。研究發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)的突變主要來自于不編碼蛋白的區(qū)域，占總突變事件的90%以上，且超過40%的突變來自于內(nèi)含子區(qū)域[35]。剪接過程中的拼接錯(cuò)誤是導(dǎo)致疾病的重要原因，遞歸剪接位點(diǎn)突變可能對某些疾病的研究具有重要意義[42]。目前，人們已對神經(jīng)元[29]及內(nèi)皮細(xì)胞[18]中的遞歸剪接事件進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)剪接位點(diǎn)與神經(jīng)系統(tǒng)疾病如帕金森綜合征、循環(huán)系統(tǒng)疾病如視網(wǎng)膜硬化或者高血壓等病變的關(guān)聯(lián)[43]。

遞歸性剪接對生物體的生長發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用。例如，剪接位點(diǎn)的選擇通過順式作用元件[44]和反式作用因子共同控制，例如SR蛋白、hnRPNs等蛋白質(zhì)。這些因素通過影響U1 snRNP，U2輔助因子和U2 snRNP剪接體的裝配來調(diào)控mRNA的序列，從而控制生物體的生長發(fā)育[45]。

遞歸性剪接還有待進(jìn)一步深入研究，目前尚待解決的問題有：(1)內(nèi)含子遞歸剪接的機(jī)制，遞歸剪接位點(diǎn)間的片段是按前后順序依次切除，還是另有其他調(diào)控方式；(2)遞歸剪接事件的發(fā)生是否與生物發(fā)育的不同階段有關(guān)；(3)遞歸剪接位點(diǎn)突變與疾病間的關(guān)系。以上問題的研究必將有助于進(jìn)一步理解RNA分子剪接機(jī)制，為疾病相關(guān)研究提供有價(jià)值的科研線索。

4 結(jié)語與展望

隨著RNA測序技術(shù)的發(fā)展與研究的深入，起初認(rèn)為內(nèi)含子是單步剪接，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)部分長內(nèi)含子存在多步遞歸剪接。目前，研究者已在人類、果蠅等多個(gè)真核生物基因組中發(fā)現(xiàn)了遞歸剪接現(xiàn)象，找到了多個(gè)遞歸剪接位點(diǎn)。雖然近年來對遞歸剪接的研究發(fā)展迅速，但是遞歸剪接位點(diǎn)突變或缺失造成的影響尚未可知，仍需要人們更進(jìn)一步的探索。隨著遞歸剪接位點(diǎn)的不斷發(fā)現(xiàn)，遞歸剪接位點(diǎn)突變或缺失在人類疾病發(fā)生發(fā)展中的功能作用將越來越清楚，為疾病的預(yù)防和治療提供新的科學(xué)線索。

三代測序技術(shù)的迅猛發(fā)展對真核生物遞歸剪接的研究具有重要的推動作用。與二代測序技術(shù)相比，三代測序技術(shù)具有測序速度更快、測序長度激增、可直接測RNA序列等特點(diǎn)[46]。三代測序技術(shù)的測序長度由二代測序的上百堿基到現(xiàn)在的幾千堿基，因此其對基因長內(nèi)含子的遞歸剪接事件的識別分析提供了更好的技術(shù)手段，相信未來會有更多有價(jià)值的遞歸剪接的生物學(xué)機(jī)制被發(fā)現(xiàn)。

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Molecular mechanisms of recursive splicing events in long introns of eukaryotes

Jinchuan Wei1, Tianyi Xu1, Jing Wu1,2, Xiaofeng Song1

Recursive splicing refers to the biological process that long introns are removed in multiple steps during pre-mRNA splicing. In comparison to large introns (>10 kb), most introns in higher eukaryotic genomes are removed in one step during transcription. Previous studies have revealed that recursive splicing events play important roles in many biological processes, including the pathogenesis and development of diseases. In recent years, more researchers have focused on recursive splicing events and found that recursive splicing occurs inand many other vertebrates. Multiple recursive splicing sites have been predicted by different bioinformatics methods and verified by experiments. Current researches focus on the process of recursive splicing, recursive splicing site recognition and its influence on biological processes. In this review, we summarize the molecular mechanism of recursive splicing events in eukaryotic genomes and the present development in this field, aiming tolay the basis for further understanding of the mechanisms of RNA splicing.

recursive splicing; lariat structure; RS-sites; Total RNA-seq

2018-10-30;

2018-12-24

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：61571223)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 61571223)]

魏金川，碩士研究生，專業(yè)方向：生物信息學(xué)。E-mail: weijc@nuaa.edu.cn

宋曉峰，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：生物信息學(xué)。E-mail: xfsong@nuaa.edu.cn

吳靜，碩士，副教授，研究方向：生物信息學(xué)。E-mail: wujing@njmu.edu.cn

10.16288/j.yczz.18-182

2019/1/16 9:14:00

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20190116.0914.001.html

(責(zé)任編委: 張根發(fā))