陳應(yīng)堅(jiān)，廖苑君，林帆，孫勝南，趙小蕾，覃繼恒，饒紹奇

?

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的網(wǎng)絡(luò)分析挖掘鼻咽癌與口腔鱗癌的共享功能模塊

陳應(yīng)堅(jiān)1,2，廖苑君1,2，林帆1,2，孫勝南1,2，趙小蕾2，覃繼恒2，饒紹奇2

1. 廣東醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，東莞 523808 2.廣東醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)系統(tǒng)生物學(xué)研究所，東莞 523808

鼻咽癌和口腔鱗癌是兩種在臨床上高度相關(guān)的疾病，從分子層面系統(tǒng)性研究這兩種疾病的相互關(guān)系卻鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)大規(guī)模的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析識(shí)別鼻咽癌和口腔鱗癌的共享功能模塊及其核心基因(一因多效模塊和基因)，以期闡明這兩種疾病共享的分子機(jī)制。從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)獲取這兩種癌癥的兩套轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，應(yīng)用倍數(shù)法和經(jīng)驗(yàn)貝葉斯方法篩選出鼻咽癌差異表達(dá)基因1279個(gè)，口腔鱗癌差異表達(dá)基因1293個(gè)，其中兩者共享基因278個(gè)。以共享基因?yàn)榉N子，通過(guò)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作知識(shí)引導(dǎo)構(gòu)建基因網(wǎng)絡(luò)，其中最大子網(wǎng)包含1290個(gè)基因和1766互作對(duì)。應(yīng)用Newman算法提取了15個(gè)共享功能模塊。對(duì)這些模塊進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，挖掘出58個(gè)核心基因，包括已知的與鼻咽癌或口腔鱗癌相關(guān)的基因(如、、、和等)和鮮有報(bào)道的基因(如、、、和等)。通路富集分析發(fā)現(xiàn)鼻咽癌和口腔鱗癌的共享功能模塊參與多個(gè)生物學(xué)通路，包括p53信號(hào)通路、ECM受體相互作用、黏著斑、細(xì)胞周期等。本研究表明鼻咽癌和口腔鱗癌具有相似的致癌機(jī)制，所挖掘的共享模塊可能是這兩種疾病演化的核心分子相互作用機(jī)制。

鼻咽癌；口腔鱗癌；基因芯片；網(wǎng)絡(luò)分析；基因多效性

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是一種起源于鼻咽上皮的鱗狀細(xì)胞癌[1]，在中國(guó)南方有很高的發(fā)病率?？谇击[狀細(xì)胞癌(oral squamous cell car-cinoma, OSCC)是發(fā)生于口腔黏膜上皮的惡性腫瘤，是全球性第六大常見(jiàn)癌癥[2]。NPC和OSCC在組織類(lèi)型、流行病學(xué)、發(fā)病機(jī)制及治療方法上具有較高的相似性和相關(guān)性，提示兩者之間擁有共同的致病因素，而這個(gè)致病因素則可能來(lái)自共享的遺傳因子—基因。這種一個(gè)基因座(locus)影響兩個(gè)或多個(gè)性狀(phenotypic trait)的現(xiàn)象稱(chēng)為基因多效性[3](pleiot-ropy)，在癌癥的遺傳機(jī)制中普遍存在。例如，抑癌基因在細(xì)胞中具有磷酸酶依賴(lài)性活性和非磷酸酶依賴(lài)性活性，并控制著多種生物過(guò)程，包括維持基因組的穩(wěn)定性、細(xì)胞存活、遷移、增殖和代謝，是已知的與多種癌癥相關(guān)的多效性基因[4]。因此，挖掘NPC與OSCC的共享風(fēng)險(xiǎn)功能模塊及其基因?qū)ふ腋行У脑\斷方法，深度研究?jī)烧甙l(fā)病機(jī)制以及有效地預(yù)防NPC和OSCC具有重要意義。

近年來(lái)，基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)迅速增加，利用生物信息學(xué)方法對(duì)基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行深入研究已成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。目前對(duì)單一疾病的基因生物信息學(xué)的研究較多，然而對(duì)多種疾病的基因生物信息學(xué)的研究較少，因此，本研究利用大規(guī)模的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)來(lái)尋找NPC和OSCC的共享風(fēng)險(xiǎn)基因及其共享基因功能模塊，以探索這兩種疾病共享的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Expression Omnibus, http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中分別下載NPC和OSCC基因表達(dá)譜芯片原始數(shù)據(jù)。選取的NPC數(shù)據(jù)集編號(hào)是GSE12452，平臺(tái)編號(hào)是GPL570。選取的OSCC數(shù)據(jù)集編號(hào)是GSE3524，平臺(tái)編號(hào)是GPL96。用于網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作(protein-protein in-teraction, PPI)數(shù)據(jù)來(lái)源為人類(lèi)蛋白互作數(shù)據(jù)庫(kù)(Human Protein Reference Database, HPRD)。目前HPRD數(shù)據(jù)庫(kù)收錄了41 327對(duì)蛋白互作數(shù)據(jù)(版本號(hào)為Release 9)，是目前數(shù)據(jù)庫(kù)中關(guān)于人類(lèi)蛋白互作數(shù)據(jù)可信度最高的數(shù)據(jù)庫(kù)之一。

1.2 芯片數(shù)據(jù)的預(yù)處理

預(yù)處理通過(guò)質(zhì)量控制，剔除不及格的芯片數(shù)據(jù)，只保留及格的進(jìn)入下一步處理。然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化，將芯片數(shù)據(jù)中的基因表達(dá)值變換到一個(gè)可以比較的水平。本研究采用NUSE箱線(xiàn)圖完成數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制。若所有芯片的質(zhì)量都非?？煽?，則NUSE值都在1附近；若NUSE值大于1.05，則芯片質(zhì)量就有問(wèn)題。本研究下載的基因芯片原始數(shù)據(jù)統(tǒng)一用RMA (Robust Multi-array Analysis)一體化算法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和對(duì)數(shù)化。該過(guò)程利用R語(yǔ)言“affy”軟件包完成。

1.3 差異表達(dá)基因的篩選

采用倍數(shù)法(fold change, FC)和經(jīng)驗(yàn)貝葉斯方法(empirical Bayes, EB)評(píng)估基因在病例對(duì)照中的差異表達(dá)程度和統(tǒng)計(jì)顯著性。本研究采用相應(yīng)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的Affymetrix注釋文件分別將兩套芯片的探針編號(hào)注釋為基因名稱(chēng)，若多個(gè)探針對(duì)應(yīng)一個(gè)基因，則取所有探針的平均值作為基因的表達(dá)值。設(shè)定值小于0.01且logFC的絕對(duì)值大于1，即FC>2作為閾值分別篩選NPC和OSCC的差異表達(dá)基因，然后對(duì)兩種疾病的差異表達(dá)基因取交集，得到二者的共享風(fēng)險(xiǎn)基因。該過(guò)程利用R語(yǔ)言“l(fā)imma”軟件包完成。

1.4 NPC與OSCC共享風(fēng)險(xiǎn)基因網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將篩選得到的NPC與OSCC共享風(fēng)險(xiǎn)基因作為初始種子基因(seed gene)。然后，將初始種子基因及其在PPI中的一級(jí)鄰居基因，作為本研究構(gòu)建NPC與OSCC共享風(fēng)險(xiǎn)基因網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)集合，對(duì)于集合中任意兩個(gè)不同基因，如果其基因產(chǎn)物在PPI網(wǎng)絡(luò)中存在互作，即視為網(wǎng)絡(luò)中的連線(xiàn)，從而構(gòu)建的NPC與OSCC共享風(fēng)險(xiǎn)基因網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)Cytoscape軟件(版本3.6.1)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)可視化。

1.5 識(shí)別NPC與OSCC共享風(fēng)險(xiǎn)功能模塊

功能模塊在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的一個(gè)重要特征是功能模塊內(nèi)的基因間存在高度緊密的相互作用和聯(lián)系，而模塊內(nèi)連接密度相比與其他功能模塊間的聯(lián)系要高很多?；谠撗芯考僭O(shè)，本研究擬對(duì)所構(gòu)建的NPC與OSCC共享風(fēng)險(xiǎn)基因網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊的劃分。本研究采用Newman算法[5,6]對(duì)NPC與OSCC共享風(fēng)險(xiǎn)基因網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分解，挖掘網(wǎng)絡(luò)中高度模塊化的功能模塊。該算法將網(wǎng)絡(luò)分解問(wèn)題轉(zhuǎn)變成二次型優(yōu)化問(wèn)題，即求使目標(biāo)函數(shù)最大的列向量的取值：

其中是初始種子基因及其在PPI中的一級(jí)鄰居基因組成的集合，是集合的鄰接矩陣(adjacent matrix)，用于表示網(wǎng)絡(luò)中基因間的相互連接關(guān)系，A=1表示網(wǎng)絡(luò)中基因和基因存在蛋白互作，反之A=0。是網(wǎng)絡(luò)中邊的數(shù)目，k和k分別代表節(jié)點(diǎn)和節(jié)點(diǎn)的連通度。是取值為1或-1的指示向量，s表示基因所屬模塊的情況，即

根據(jù)柯西(Cauchy)不等式，當(dāng)取矩陣的最大特征值對(duì)應(yīng)的特征向量時(shí)，目標(biāo)函數(shù)達(dá)到最大值。由于只取1或-1，因此只保留特征向量對(duì)應(yīng)元素的正負(fù)號(hào)，從而根據(jù)特征向量的正負(fù)號(hào)將網(wǎng)絡(luò)分解為兩個(gè)子模塊，重復(fù)這個(gè)過(guò)程，直到網(wǎng)絡(luò)不能繼續(xù)分解時(shí)，即可完成對(duì)網(wǎng)絡(luò)的分解。最終，本研究將節(jié)點(diǎn)數(shù)大于30的子網(wǎng)絡(luò)定義為網(wǎng)絡(luò)模塊。

1.6 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治雠c核心基因的識(shí)別

本研究對(duì)挖掘出的每個(gè)功能模塊的拓?fù)鋵傩赃M(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)指標(biāo)包括：

(1)網(wǎng)絡(luò)直徑：指網(wǎng)絡(luò)中任意兩個(gè)連通節(jié)點(diǎn)間距離的最大值。網(wǎng)絡(luò)直徑代表了網(wǎng)絡(luò)中任意兩個(gè)節(jié)點(diǎn)間可能出現(xiàn)的最遠(yuǎn)距離，可從側(cè)面反映網(wǎng)絡(luò)的緊密性。

(2)特征路徑長(zhǎng)度：即模塊中所有節(jié)點(diǎn)間的最短路徑的平均值，反映了模塊的緊密程度；

(3)連通度：即模塊中直接與某一節(jié)點(diǎn)相連的邊的數(shù)目，它不僅反映了單一節(jié)點(diǎn)在模塊中的最基本的拓?fù)湫再|(zhì)，而且是判斷無(wú)標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)屬性的重要指標(biāo)。無(wú)標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)是網(wǎng)絡(luò)中連通度的分布符合冪律分布，即()∝a，其中為接通度，α是指數(shù)參數(shù)，可通過(guò)極大似然法估計(jì)。通過(guò)Kolmogorov-Smirnov (KS)擬合優(yōu)度檢驗(yàn)評(píng)判網(wǎng)絡(luò)的無(wú)標(biāo)度性質(zhì)。

無(wú)標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)的屬性很大程度上由少數(shù)的節(jié)點(diǎn)即核心基因(hub gene)決定的。雖然網(wǎng)絡(luò)具有抗隨機(jī)擾動(dòng)的能力，但對(duì)中心節(jié)點(diǎn)的作用卻很敏感。核心基因的識(shí)別一般通過(guò)檢驗(yàn)其在網(wǎng)絡(luò)中的連通度是否高出隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)下的連通度期望值。該零假設(shè)可以通過(guò)泊松分布進(jìn)行檢驗(yàn)。那么，在一個(gè)節(jié)點(diǎn)數(shù)為N的隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)中，某節(jié)點(diǎn)連通度等于的概率為：

其中，=N，表示隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的期望連通度，是網(wǎng)路中任意兩個(gè)節(jié)點(diǎn)發(fā)生連接的概率。為控制假陽(yáng)性率，F(xiàn)DR<0.01作為顯著性水平。上述網(wǎng)絡(luò)分析通過(guò)R軟件實(shí)現(xiàn)，其中部分分析借助“igraph”軟件包完成。

1.7 KEGG通路富集分析

KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路通過(guò)描述基因編碼的生物大分子酶或者蛋白質(zhì)間相互聯(lián)系相互影響的情況以闡釋基因及其產(chǎn)物的功能[7]。本研究利用在線(xiàn)注釋網(wǎng)站DAVID軟件(版本6.8)對(duì)每一個(gè)模塊進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析。為控制假陽(yáng)性率，采用Fisher精確檢驗(yàn)的方法，富集結(jié)果取FDR<0.001作為顯著性基因富集。

2 結(jié)果與分析

2.1 芯片數(shù)據(jù)的預(yù)處理

從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)獲取NPC與OSCC基因表達(dá)譜芯片原始數(shù)據(jù)后，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理。采用NUSE箱線(xiàn)圖的數(shù)據(jù)處理結(jié)果分別見(jiàn)圖1A和圖1B。結(jié)果顯示，NPC的正常樣本GSM312899、GSM312902和OSCC的正常樣本GSM80520、腫瘤樣本GSM80471的NUSE 值均大于1.05，說(shuō)明這4個(gè)樣本的芯片存在質(zhì)量問(wèn)題。為保證后續(xù)分析計(jì)算結(jié)果的可信度，刪除NPC的正常樣本GSM312899、GSM312902和OSCC的正常樣本GSM80520、腫瘤樣本GSM80471，最終獲得的有效樣本包括NPC正常樣本8個(gè)和腫瘤樣本31個(gè)，OSCC正常樣本3個(gè)和腫瘤樣本15個(gè)。基于RMA一體化算法，使用R語(yǔ)言“affy”包對(duì)兩種疾病的樣本芯片數(shù)據(jù)分別進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和對(duì)數(shù)化。

圖1 NUSE箱線(xiàn)圖

A：NPC基因表達(dá)譜芯片的NUSE箱線(xiàn)圖；B：OSCC基因表達(dá)譜芯片的NUSE箱線(xiàn)圖。

2.2 差異表達(dá)基因的篩選

采用倍數(shù)法和經(jīng)驗(yàn)貝葉斯檢驗(yàn)方法，按照值小于0.01且logFC的絕對(duì)值大于1為閾值，共篩選出NPC差異表達(dá)基因1279個(gè)，OSCC差異表達(dá)基因1293個(gè)，二者的共同差異表達(dá)基因278個(gè)。

2.3 NPC與OSCC共享風(fēng)險(xiǎn)基因網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過(guò)提取種子基因及其在PPI網(wǎng)絡(luò)中的一級(jí)鄰居，最終構(gòu)建出38個(gè)大小不同的獨(dú)立的基因互作網(wǎng)絡(luò)，包含1412個(gè)節(jié)點(diǎn)和1851條邊，其中節(jié)點(diǎn)表示蛋白(或稱(chēng)基因)，邊表示蛋白互作，見(jiàn)圖2。最大子網(wǎng)絡(luò)由1290個(gè)節(jié)點(diǎn)和1766條邊組成。后面的分析均基于網(wǎng)絡(luò)中的最大子網(wǎng)進(jìn)行。

2.4 疾病網(wǎng)絡(luò)模塊與核心基因的識(shí)別

利用Newman 算法對(duì)最大子網(wǎng)進(jìn)行分解，最終得15個(gè)節(jié)點(diǎn)數(shù)大于30的功能模塊。表1列出了各模塊的基本特征和拓?fù)鋵傩?。可以發(fā)現(xiàn)規(guī)模大的模塊其包含的初始種子基因相對(duì)多，平均每個(gè)節(jié)點(diǎn)連接的邊數(shù)也多。不同網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)相差也很大，最大的模塊(M1)由196個(gè)基因(其中初始種子基因有18個(gè))及270條邊，平均每個(gè)節(jié)點(diǎn)含有1.4條邊，然而最小的模塊(M14和M15)由34個(gè)基因(其中初始種子基因分別有3個(gè)和9個(gè))和34條邊組成，平均每個(gè)節(jié)點(diǎn)含有1條邊。這些模塊的拓?fù)鋵傩越咏?，網(wǎng)絡(luò)直徑變化范圍在4~9，特征路徑長(zhǎng)度均小于6，符合“六度分離理論”[8]，各模塊的指數(shù)參數(shù)α估計(jì)值在2~3之間，符合生物學(xué)上無(wú)標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)的常見(jiàn)表現(xiàn)。本研究對(duì)節(jié)點(diǎn)連通度是否符合冪律分布進(jìn)行KS擬合優(yōu)度檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果顯示各模塊的連通度均近似服從冪律分布(>0.05)，支持了各模塊的無(wú)標(biāo)度性，可認(rèn)為是無(wú)標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)。

圖2 NPC與OSCC共享的差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

紅色節(jié)點(diǎn)表示上調(diào)差異表達(dá)基因編碼蛋白；綠色表示下調(diào)差異表達(dá)基因編碼蛋白，藍(lán)色表示其他蛋白。

表1 各模塊的基本特征和拓?fù)鋵傩?/p>

α值為估計(jì)的冪律分布的指數(shù)參數(shù)；P值為KS檢驗(yàn)的P值。

利用泊松檢驗(yàn)，設(shè)定顯著性水準(zhǔn)為FDR<0.01，共得到58個(gè)核心基因。通過(guò)檢索PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)，本研究發(fā)現(xiàn)共有34個(gè)核心基因被報(bào)道與NPC或OSCC相關(guān)，它們直接或間接參與了NPC和OSCC的發(fā)生發(fā)展，如增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、周期蛋白依賴(lài)激酶1 (cyclin- dependent kinase 1,CDK1)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1 (signal transducer and activator of transcription 1, STAT1)、趨化因子CCL5 (C-C motif chemokine ligand 5, CCL5)等蛋白的編碼基因。其余24個(gè)核心基因暫無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道與NPC或OSCC相關(guān)，這些基因可能對(duì)疾病的發(fā)生發(fā)展提供新的預(yù)測(cè)方向，如母體胚胎亮氨酸拉鏈激酶(maternal embryo leucine zipper kinase, MELK)、非轉(zhuǎn)移性細(xì)胞蛋白1 (non-metastatic cell protein 1, NME1)、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-6 (caspase-6, CASP6)、RacGCT酶活性蛋白-1 (RACGAP1)、抑制素β A亞基基因(inhibin subunit beta A, INHBA)等蛋白的編碼基因。核心基因數(shù)占模塊中的初始種子基因數(shù)的44.6%。含有核心基因最多的模塊是M2模塊，共有10個(gè)核心基因。而含有核心基因最少的模塊是M10模塊，僅有含有1個(gè)核心基因(表2)。

2.5 模塊的功能富集分析

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，除了模塊M6、M9、M10、M13、M14、M15外，其余9個(gè)模塊至少富集到一條生物學(xué)通路(表3)。這些模塊的顯著富集于ECM受體相互作用(hsa04512)、黏著斑(hsa04510)、細(xì)胞周期(hsa04110)、P53信號(hào)通路(hsa04115)、PI3K-Akt信號(hào)通路(hsa04151)、細(xì)胞因子—細(xì)胞因子受體相互作用(hsa04060)等45個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)通路(FDR值<0.001)。本研究根據(jù)富集到的KEGG通路類(lèi)別評(píng)估了這9個(gè)功能模塊之間的相互作用。為了清楚地展示各模塊之間的關(guān)系，本研究用Cytoscape軟件畫(huà)出模塊和通路分類(lèi)關(guān)系圖(見(jiàn)圖3)。圖中的功能類(lèi)是KEGG通路的分類(lèi)：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)；信號(hào)分子和相互作用(signaling molecules and interaction)；細(xì)胞運(yùn)動(dòng)(cell motility)；細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡(cell growth and death)；復(fù)制與修復(fù)(replication and repair)；細(xì)胞通訊(cell communication)；免疫系統(tǒng)(immune system)；內(nèi)分泌系統(tǒng)(endocrine system)；癌癥(cancer)；心血管疾病(cardiovascular diseases)；發(fā)育(development)；消化系統(tǒng)(digestive system)；折疊、分類(lèi)和降解(folding, sorting and degradation)；傳染病(infectious diseases)。其中細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡(M1、M2、M5和M8)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(M3、M4、M7和M11)連通度最高，體現(xiàn)了這些功能與NPC和OSCC的發(fā)病機(jī)制有密切的聯(lián)系。本研究的結(jié)果表明，各模塊之間不是孤立的，功能相一致的模塊之間相互作用，共同影響疾病的發(fā)生發(fā)展。

表2 各個(gè)模塊的核心基因

*已有文獻(xiàn)報(bào)道該基因與鼻咽癌和口腔鱗癌相關(guān)。

表3 各個(gè)模塊的KEGG通路分析結(jié)果

3 討論

基因多效性是癌癥遺傳機(jī)制中的普遍現(xiàn)象，大量全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study, GWAS)的結(jié)果已經(jīng)證實(shí)不同癌癥表型可共享風(fēng)險(xiǎn)基因，即單個(gè)基因的突變可能引起不同的病理效應(yīng)而參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展[9]。基于基因多效性，本研究從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分別下載NPC和OSCC基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因分析，以PPI知識(shí)為向?qū)?，兩種癌癥的共同差異表達(dá)基因?yàn)榉N子基因，構(gòu)建NPC與OSCC共享風(fēng)險(xiǎn)基因網(wǎng)絡(luò)。本研究利用Newman算法對(duì)NPC與OSCC共享風(fēng)險(xiǎn)基因網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分解，挖掘網(wǎng)絡(luò)中高度模塊化的共享功能模塊和核心基因。通過(guò)闡明功能模塊行使的生物學(xué)功能來(lái)挖掘NPC與OSCC的共享通路。

圖3 共享功能模塊與通路的關(guān)系圖

在本研究中，共提取了15個(gè)NPC與OSCC相關(guān)的功能模塊，并通過(guò)包括直徑、特征路徑長(zhǎng)度、連通度等拓?fù)鋵傩灾笜?biāo)評(píng)價(jià)各模塊的拓?fù)湫再|(zhì)，結(jié)果顯示各個(gè)模塊都滿(mǎn)足無(wú)標(biāo)度性。模塊中的核心基因擔(dān)負(fù)著維系模塊中各基因間相互聯(lián)系和模塊結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的作用，在模塊行使特定生物學(xué)功能的過(guò)程中肩負(fù)著功能核心的作用，是功能模塊必不可少的關(guān)鍵基因。通常，研究模塊中核心基因的功能有助于闡明模塊的生物學(xué)功能。

多數(shù)核心基因，如、、STAT1和等基因均被報(bào)道直接或間接與NPC和OSCC相關(guān)。它們可能直接或間接參與了腫瘤的生長(zhǎng)和分化，如癌細(xì)胞的增殖、血管形成，侵襲和轉(zhuǎn)移等。例如，基因的表達(dá)在真核細(xì)胞DNA復(fù)制的調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用，是與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因。有研究表明，靶向基因的小干擾RNA (siRNA)通過(guò)沉默基因，可有效抑制對(duì)NPC細(xì)胞增殖的作用[10]。最近研究發(fā)現(xiàn)，高度侵襲性腫瘤表現(xiàn)出突變和活性，從而提高OSCC侵襲前的增殖能力[11]，可用于評(píng)估異型增生和不同級(jí)別口腔鱗癌的增殖能力和侵襲性[12]。還有研究稱(chēng)，PCNA可以成為區(qū)分正?？谇徽衬ず涂谇击[癌組織的生物標(biāo)志物[13]。通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞中心體周期和有絲分裂的發(fā)生，在真核細(xì)胞周期的調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前有文獻(xiàn)報(bào)道，通過(guò)草酸鹽對(duì)乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)的抑制，調(diào)控CDK1/cyclinb1通路，從而誘導(dǎo)G2/M細(xì)胞周期阻滯。CDK1/cyclin B1通路有望成為NPC治療的靶點(diǎn)[14]。Chen等[15]報(bào)道發(fā)現(xiàn)，在OSCC中高表達(dá)，可能與OSCC的惡性程度有關(guān)，可作為判斷OSCC惡性程度和預(yù)測(cè)預(yù)后的有用指標(biāo)。可能在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)免疫監(jiān)視、凋亡和細(xì)胞周期阻滯方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]。最近有研究報(bào)道，表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞周期S期減少，G2/M期增加，有助于提高NPC細(xì)胞的放射敏感性[17]。有研究表明，的活化主要見(jiàn)于分化程度較高的腫瘤，如果OSCC患者的腫瘤中保留了的表達(dá)，并表現(xiàn)出的活化，則對(duì)輔助化療有較好的療效[18]。近年來(lái)報(bào)道證實(shí)，能直接參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在前列腺癌[19]、結(jié)腸癌[20]、肺癌[21]、乳腺癌[22]中都有過(guò)表達(dá)，并被證明通過(guò)不同的信號(hào)途徑促進(jìn)多種癌癥類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和(或)運(yùn)動(dòng)。CCL5通過(guò)PI3K/AKT和HIF-1a途徑誘導(dǎo)腫瘤血管生成，與人鼻咽癌血管生成密切相關(guān)，是NPC潛在的治療靶點(diǎn)[23]。在慢性炎癥狀態(tài)下CCL5能激活VEGF和(或) STAT信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管生成，可通過(guò)激活STAT和NF信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤形成[24]。有研究證實(shí)，CCL5通過(guò)其特異性高親和力受體CCR5的誘導(dǎo)，增加OSCC的移動(dòng)力[25]。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)了一些鮮有報(bào)道的與NPC和OSCC相關(guān)的核心基因，例如、、和等基因。這些核心基因在其他腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，可能與NPC和OSCC也存在密切相關(guān)。例如，高表達(dá)，與肝癌[26]、腎上腺皮質(zhì)癌[27]、乳腺癌[28]、胃癌[29]和腦癌[30]患者預(yù)后不良相關(guān)。在肝癌中高表達(dá)，可通過(guò)FOXM1/b-catenin信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因和有絲分裂進(jìn)程，沉默可以降低肝癌細(xì)胞的活力和增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和有絲分裂，的穩(wěn)定沉默能抑制肝癌細(xì)胞的侵襲、干性和致瘤性[26]。有報(bào)道指出，基因的編碼蛋白被認(rèn)為是潛在的典型轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)其DNA結(jié)合活性來(lái)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)移抑制功能等高度相關(guān)。此外，NME1也參與DNA修復(fù)，這表明NME蛋白的表達(dá)減少可能導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)展[31]。具有調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)分裂和細(xì)胞分化的作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，能激活RhoA和ERK蛋白，增強(qiáng)卵巢上皮癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力[32]。的過(guò)表達(dá)與直腸癌的進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)，其生物學(xué)和臨床意義為判斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良提供了充分的證據(jù)[33]。編碼TGF-β超家族蛋白，在不同類(lèi)型的腫瘤中發(fā)揮著重要作用。在食管腺癌中高表達(dá)，通過(guò)啟動(dòng)子去甲基化和組蛋白乙酰化可促進(jìn)細(xì)胞增殖[34]，也與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[35]。

為了闡明每個(gè)模塊的生物學(xué)功能，本研究利用DAVID在線(xiàn)軟件作了基于KEGG信號(hào)通路的富集分析。這些模塊顯著富集于ECM受體相互作用(has-04512)、黏著斑(hsa04510)、細(xì)胞周期(hsa04110)、p53信號(hào)通路(hsa04115)、PI3K-Akt信號(hào)通路(hsa04151)、細(xì)胞因子—細(xì)胞因子受體相互作用(hsa04060)等。其中最顯著相關(guān)的信號(hào)通路是ECM受體相互作用(hsa-04512, M3)。ECM在細(xì)胞形態(tài)、增殖、遷移、分化、凋亡和癌變等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[36]。黏著斑是介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)ECM粘附的調(diào)節(jié)效應(yīng)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)[37]。根據(jù)KEEG信號(hào)通路富集分析顯示，本研究富集到的ECM受體相互作用和粘著斑通路有許多基因重疊，例如編碼膠原蛋白、整合素和層粘連蛋白等基因,有密切的相互作用。這些相互作用有利于癌細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)、分化和ECM代謝，同時(shí)抑制細(xì)胞死亡、平穩(wěn)的極化生長(zhǎng)和ECM的穩(wěn)定性[38]。ECM受體相互作用和粘著斑信號(hào)通路對(duì)癌細(xì)胞有明顯調(diào)控的作用。在p53信號(hào)通路中，抑癌基因通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、凋亡或衰老，在細(xì)胞對(duì)各種應(yīng)激信號(hào)的反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[39]。的失活能使調(diào)控的靶基因異常增殖和(或)表達(dá)缺失，可使細(xì)胞周期G1/S檢查點(diǎn)失控，細(xì)胞凋亡失控，導(dǎo)致細(xì)胞癌變[40]。另外，模塊與模塊之間不是孤立的，功能相一致的模塊之間相互作用，共同影響疾病的發(fā)生發(fā)展。模塊M1、M2、M5和M8與細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡有關(guān)，共同調(diào)控細(xì)胞周期。模塊M3和M7主要富集于ECM受體相互作用與黏著斑信號(hào)通路，共同協(xié)調(diào)參與癌細(xì)胞的增殖與遷移。M4模塊主要富集于細(xì)胞因子—細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號(hào)通路和Jak-STAT信號(hào)通路，模塊M11主要富集于TGF-β信號(hào)通路，M12主要富集于補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)信號(hào)通路，這些信號(hào)通路都參與癌癥的炎癥反應(yīng)，說(shuō)明模塊M4、M11和M12之間有密切聯(lián)系。

總而言之，本研究通過(guò)對(duì)NPC和OSCC芯片數(shù)據(jù)的挖掘以及生物信息學(xué)分析，篩選出15個(gè)共享功能模塊，58個(gè)密切相關(guān)的核心基因(如、、和等)以及p53信號(hào)通路、ECM受體相互作用、黏著斑等在NPC和OSCC的發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移可能起著重要作用的信號(hào)通路，為研究NPC與OSCC的共享發(fā)病機(jī)制、腫瘤標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)的篩選方面提供了更多的信息，有助于解釋多效性基因在致癌過(guò)程中所起的作用。除此之外，本研究還發(fā)現(xiàn)了一些鮮有報(bào)道的核心基因，如、、和等，這些新發(fā)現(xiàn)為探索NPC與OSCC的共同發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了新線(xiàn)索。綜上所述，本研究表明鼻咽癌和口腔鱗癌具有相似的致癌機(jī)制，所挖掘的共享模塊可能是這兩種疾病演化的核心分子相互作用機(jī)制。

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Shared functional modules for nasopharyngeal and oral squamous cell carcinoma identified by network analysis of transcriptomes

Yingjian Chen1,2, Yuanjun Liao1,2, Fan Lin1,2, Shengnan Sun1,2, Xiaolei Zhao2, Jiheng Qin2, Shaoqi Rao2

Although nasopharyngeal carcinoma (NPC) and oral squamous cell carcinoma (OSCC) are highly correlated clinical diseases, the underling molecular mechanisms to link the two diseases remain largely unknown. The aim of this study is to identify the shared functional modules for NPC and OSCC by using large-scale transcriptomic data. Gene expression profile datasets of NPC and OSCC were obtained from the GEO database. A total of 1279 differentially expressed genes (DEGs) of NPC and 1293 DEGs of OSCC were identified by fold change and empirical Bayes method, and 278 DEGs were common to these two diseases. These overlapped genes were translated into a primary network consisting of 1290 nodes (genes) and 1766 edges. The primary network was then decomposed into 15 compacted modules (subnets) with high modularity by Newman’s algorithm. Topological analysis of these modules identified a total of 58 hub genes, most of which (e.g.,,,,and) have been proved to be associated with NPC and/or OSCC, while the rest (e.g.,,,,, and) might be novel risk genes for the two diseases. Further bioinformatics analysis of KEGG databases revealed that these modules are involved in multiple pathogenic biological pathways for either NPC or OSCC (e.g., p53 signaling pathway, ECM-receptor interaction, focal adhesion, and cell cycle). This study demonstrates that NPC and OSCC have similar molecular bases, and the identified pleiotropic modules may shape the complicated molecular interplays underlying the two clinically correlated diseases.

nasopharyngeal carcinoma; squamous cell carcinoma; microarrays; network analysis; pleiotropism

2018-09-07;

2018-10-26

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81373085) 資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81373085)]

陳應(yīng)堅(jiān)，碩士研究生，專(zhuān)業(yè)方向：公共衛(wèi)生。E-mail: 1053879830@qq.com

饒紹奇，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：遺傳統(tǒng)計(jì)與生物信息學(xué)。E-mail: raoshaoq@gdmu.edu.cn

10.16288/j.yczz.18-215

2019/1/16 9:14:53

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20190116.0914.002.html

(責(zé)任編委: 周鋼橋)