趙　津　李　奚　李一權(quán)　周　曄　陳　爽　蘭　添　范園園　李　霄　孫麗麗　金寧一

(長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，長春130012)

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重組腺病毒Ad-HP對胃癌的抑制作用

趙津李奚李一權(quán)①周曄①陳爽①蘭添①范園園①李霄①孫麗麗②金寧一①

(長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，長春130012)

[摘要]目的：探討表達HN蛋白的重組腺病毒Ad-HP在體內(nèi)外對人胃癌細胞的抑制作用。方法：通過MTS法檢測Ad-HP(Ad-HN-PEG3p-E1a)對SGC7901細胞的增殖抑制效果，采用Annexin V染色、Caspase酶活性檢測、Western blot免疫印跡檢測揭示Ad-HP對SGC7901細胞的抑制方式和途徑。對BALB/c裸鼠進行瘤內(nèi)注射Ad-HP探究其在體內(nèi)的抗腫瘤作用。結(jié)果：體外實驗中Ad-HP明顯抑制SGC7901細胞增殖，并表現(xiàn)出時間效應(yīng)和劑量效應(yīng)關(guān)系。Ad-HP能提高Caspase酶活性，并釋放細胞色素C。體內(nèi)實驗中Ad-HP能顯著延緩瘤體生長并延長模型動物的平均生存期，而且能上調(diào)IL-2和IFN-γ等細胞因子，使免疫反應(yīng)朝向Th1優(yōu)勢。結(jié)論：Ad-HP可特異性有效抑制胃癌細胞增殖和腫瘤生長。

[關(guān)鍵詞]人胃癌細胞； 溶瘤腺病毒；新城疫；PEG-3

全球范圍內(nèi)，胃癌現(xiàn)位居發(fā)病率第4位和死亡率第2位[1]。現(xiàn)階段是通過外科手術(shù)、化學(xué)療法和放射療法聯(lián)用治療胃癌的[2]。但預(yù)后效果較差，早期胃癌患者術(shù)后5年生存率僅有25%～35%，晚期患者的平均存活期只有10～14個月[3-6]。傳統(tǒng)療法治療腫瘤是非特異性的，并伴有嚴重的毒副作用,這使我們急需研發(fā)一種針對腫瘤細胞的藥物來治療癌癥[7]。而溶瘤病毒是一種非病原病毒，能選擇性感染和殺傷腫瘤細胞，同時不損傷正常細胞，它的出現(xiàn)為腫瘤治療帶來了新希望[8]。

基于新城疫病毒(NDV)的抗癌性、腫瘤特異性、高效性及安全性，使其成為極具潛質(zhì)的治療藥物。NDV是以單鏈反式RNA包膜的副粘病毒，能表達兩種表面蛋白：血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)和融合蛋白(F)。HN蛋白既能將病毒吸附在富含唾液酸的宿主細胞受體表面，也能從細胞中釋放病毒。而且HN蛋白在病毒感染時能誘導(dǎo)免疫保護，因而易受抗體免疫選擇壓作用影響產(chǎn)生抗原變異。此外，HN能在人外周血細胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-α和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)，進而激活細胞凋亡途徑，因此HN能用于抗腫瘤治療[9，10]。

編碼鼠蛋白基因的最小啟動子區(qū)PEG-3是腫瘤特異性啟動子，能表達下游基因，已在大腦、前類腺、乳腺、胰腺和黑色素瘤等腫瘤組織中得到證實。PEG-3的特異性需轉(zhuǎn)錄因子AP-1和PEA-3共同調(diào)節(jié)[11，12]。

本課題目的在于研究表達HN蛋白的重組腺病毒對人胃癌細胞SGC7901的抑制作用。實驗中利用MTS檢測研究Ad-HP對SGC7901的體外抑制作用；通過Annexin V染色、caspase酶活性檢測和Western blot來判斷探討其抑制方式和途徑；最終經(jīng)動物模型檢測Ad-HP對人胃癌細胞的體內(nèi)抑制作用。

1材料與方法

1.1細胞和病毒人胃癌細胞SGC7901由本室保存，重組腺病毒Ad-HP(Ad-HN-PEG3p-E1a)、Ad-HN(Ad-HN)、Ad-GP(Ad-EGFP-PEG3p-E1a)和Ad-EGFP(Ad-EGFP)均由本室構(gòu)建并鑒定。

1.2主要試劑MTS購自Sigma公司，Annexin V 細胞凋亡檢測試劑盒、caspase檢測試劑盒為碧云天生物研究所產(chǎn)品，F(xiàn)BS、RPMI1640培養(yǎng)液購自HyClone公司，ECL 試劑盒購自Pierce 公司，抗Cytochrome C抗體、抗GAPDH 抗體、抗PARP 抗體、抗La min A 抗體、抗鼠IgG 和抗兔IgG為Cell signaling 公司產(chǎn)品，6～8周齡雌性BALB/c裸鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。

1.3MTS法檢測將SGC7901細胞按5×103個/孔接種于96孔板，以不同用量(1、10、100 moi)的 Ad-HP、Ad-GP、Ad-HN和Ad-EGFP分別感染細胞，分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后，加20 μl/孔MTS/PMS混合液，于37℃、5%CO2孵育1～4 h，酶標儀檢測490 nm處吸收值D。細胞增殖抑制率=(對照組D值-實驗組D值)/對照組D值×100%。

1.4Annexin V染色將SGC7901細胞按1×106個/孔接種于6孔板，以100 moi劑量的Ad-HP、Ad-HN、Ad-EGFP和Ad-GP分別感染細胞，48 h后收集細胞，用195 μl binding-buffer重懸細胞后加5 μl Annexin V-FITC，避光作用10 min，離心，再重懸細胞于190 μl binding-buffer后加10 μl PI，混勻后用熒光顯微鏡觀察。

1.5caspase酶活性檢測將SGC7901細胞按1×105個/孔接種于6孔板，以100 moi劑量的Ad-HP、Ad-HN、Ad-EGFP和Ad-GP分別感染細胞，培養(yǎng)48 h收集細胞，加500 μl裂解液，置冰上15 min，離心15 min(4℃、12 000 r/min)，加Ac-DEVD-pNA、Ac-VEID-pNA和 Ac-YVAD-pNA反應(yīng)底物，作用1～2 h，酶標儀于405 nm檢測caspase酶活性。

1.6Western blot細胞接種和病毒感染同1.3，48 h后收集細胞提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后定量蛋白，于10%SDS-PAGE電泳后分離，轉(zhuǎn)NC膜，5%脫脂乳封閉1 h，TBST洗膜，加入稀釋后一抗，反應(yīng)1.5 h，洗膜3次后加入二抗(抗兔或抗鼠的IgG)，再洗膜后加ECL顯色劑，于暗房中顯影、定影后進行分析。

1.7動物實驗于小鼠右后肢皮下注射SGC7901細胞懸液0.1 ml(1×106個細胞)，每3d測量瘤體長徑(L)和短徑(W)，計算體積V=0.52×LW2，待長到米粒大小，隨機分5組( 10只/組)，A-E組相應(yīng)為生理鹽水對照組、Ad-HP組、Ad-HN組、Ad-GP組及Ad-EGFP組，注射劑量1×108PFU/只/次/100 μl，每周1次，共4次；并每日觀察5組小鼠存活狀態(tài)，采集小鼠外周血，分離血清，按試劑盒說明檢測IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ細胞因子水平。

2結(jié)果

2.1Ad-HP對胃癌SGC7901細胞的抑制作用如圖1所示，同Ad-EGFP相比，Ad-HP、Ad-GP、Ad-HN均對SGC7901細胞有抑制作用，且大部分試驗點Ad-HP和Ad-GP抑瘤作用更強。感染劑量為1和10 moi時，48 h后Ad-HP、Ad-GP、Ad-HN才對SGC7901細胞有明顯抑制作用(P<0.05)；感染劑量為100 moi時的抑瘤效果均優(yōu)于1和10 moi，72 h時Ad-HN的抑制率達到峰值(30.6±5.6)%后又下降，Ad-HP和Ad-GP在96 h抑制率分別可達到(41.6±2.3)%和(39.7±1.1)%。

2.2細胞凋亡檢測結(jié)果如圖2所示，經(jīng)Annexin V/PI染色后，觀察到Ad-HP和Ad-HN感染后，有部分細胞經(jīng)PI染色呈紅色，說明細胞開始凋亡，且Ad-HP 感染導(dǎo)致的細胞凋亡數(shù)更多。Ad-HP的早期及晚期凋亡分別占總細胞數(shù)8.53%和 8.98%，Ad-HN的早期及晚期凋亡分別占總細胞數(shù) 5.31%和 5.51%。

圖1　Ad-HP對SGC7901細胞的抑制作用Fig.1　Inhibitory effects of Ad-HP on SGC7901 cells

2.3caspase酶活性檢測結(jié)果如圖3所示，在Ad-EGFP、Ad-HP、Ad-HN分別感染SGC7901細胞48 h后，caspase-3、caspase-8和caspase-9的活性均不同程度高于對照組，Ad-HP和Ad-HN尤為明顯，表明Ad-HP和Ad-HN具有顯著上調(diào)caspase-3、caspase-8和caspase-9酶的作用(P<0.05)，但兩者間無明顯差異(P>0.05)。

2.4Western blot檢測結(jié)果如圖4所示，在Ad-EGFP、Ad-HP、Ad-HN分別感染SGC7901細胞48 h后，Ad-HP和Ad-HN組產(chǎn)生了同Cytochrome C抗體結(jié)合的特異性條帶，而對照組和Ad-EGFP組中均未檢測到該條帶。

2.5模型動物腫瘤生長趨勢及生存期分析如圖5所示，SGC7901細胞小鼠移植瘤經(jīng)重組腺病毒治療后，2.5周后Ad-GP、Ad-HN、Ad-HP治療組瘤體體積明顯比生理鹽水組和Ad-EGFP小，并且瘤體生長趨勢明顯減緩，表明具有一定的抑瘤效果。如圖6所示，生理鹽水組、Ad-EGFP和Ad-HN三組的平均生存期分別僅為13、12.8和14.4 d；與之相比，Ad-GP和Ad-HP治療組的平均生存期明顯延長，可分別達至20和20.4 d。

圖2　Ad-HP感染對SGC7901細胞凋亡的影響Fig.2　Effect of Ad-HP on apoptosis of SGC7901

圖3　SGC7901細胞中caspase酶活性檢測結(jié)果Fig.3　Analysis of caspase in SGC7901

2.6細胞因子水平檢測同空白對照組和生理鹽水對照組相比，Ad-HN和Ad-HP治療組在IL-2和IFN-γ的含量明顯高于Ad-GP和Ad-EGFP組，但兩者間無顯著差異(P>0.05)。但對照組和治療組中IL-4和IL-10的含量各組間并無明顯差異(P>0.05)。

圖4　Ad-HP感染對SGC7901細胞中Cytochrome C釋放的影響Fig.4　Effect of Ad-HP on Cytochrome C in SGC7901 cellsNote: 1.Control;2.Ad-EGFP;3.Ad-HP;4.Ad-HN.

圖5　小鼠腫瘤生長趨勢圖Fig.5　Tumor growth kinetics of mice

圖6　Ad-HP延長小鼠平均生存期Fig.6　Ad-HP extended average survival times of mice

圖7　小鼠細胞因子含量(pg/ml)Fig.7　Cytokine content in mice(pg/ml)

3討論

目前基因治療已發(fā)展成熟，攜帶抗癌基因的溶瘤病毒已成為腫瘤病毒療法的關(guān)注焦點，利用具備抑瘤基因、促細胞凋亡基因、抗血管生成基因、自殺性基因、RNA干擾基因和免疫調(diào)節(jié)等功能基因進行治療[13]?；谌芰鱿俨《灸軓V泛應(yīng)用，有多種抑瘤機制，包括細胞溶解、誘發(fā)凋亡、毒蛋白表達、自噬、終止蛋白合成等都能引發(fā)抗腫瘤免疫，因此使其成為腫瘤治療中的有效手段[13,14]。20世紀末，NDV作為一個熱點研究領(lǐng)域出現(xiàn)，不僅源于其經(jīng)濟價值更關(guān)注其溶瘤潛能，并且對人無致病性，無毒副作用，使用相對安全。NDV能有效誘導(dǎo)合成像IFN和腫瘤壞死因子等細胞因子，通過應(yīng)用重組NDV表達如IL-2和TNF-α免疫刺激因子來增強NDV溶瘤特性。因此利用NDV重組腺病毒進行抗腫瘤治療是一種醫(yī)療趨勢。

本研究評價了Ad-HP、Ad-GP、Ad-HN及Ad-EGFP四種重組腺病毒對人胃癌細胞SGC7901的體內(nèi)外抑制作用。結(jié)果表明，Ad-HP和Ad-GP對SGC7901細胞生長和增殖的抑制作用明顯強于另兩組。當延長感染時間和增加感染劑量時，抑制效果顯著增強，表現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)關(guān)系。Ad-HP和Ad-GP中都插入了PEG-3基因，表明PEG-3能限制腫瘤細胞生長增殖。目前已有多個課題組報道了PEG-3在治療乳腺癌、黑色素瘤等惡性腫瘤方面的應(yīng)用，證實了PEG-3是腫瘤特異性啟動子，能參與靶向性基因治療[11，12]。

凋亡是細胞程序性死亡，能除去有害及嚴重受損的細胞，并維持多細胞生物內(nèi)的組織穩(wěn)態(tài)。目前很多病毒都能誘發(fā)感染細胞的凋亡和病變效應(yīng)。幾項研究表明，NDV能在感染細胞內(nèi)激活內(nèi)源性線粒體途徑和外源性死亡受體途徑，最終誘導(dǎo)caspase依賴途徑引發(fā)細胞凋亡，使細胞發(fā)生生化性質(zhì)和形態(tài)學(xué)改變[15，16]。線粒體釋放出細胞色素C，在dATP存在時與凋亡相關(guān)因子1(Apaf-1)結(jié)合形成多聚體，促使caspase-9與其結(jié)合形成凋亡小體激活caspase-9，caspase-9再激活其他caspase如caspase-3等，從而誘導(dǎo)細胞凋亡。本實驗中Ad-HP和Ad-HN組Western blot檢測到細胞色素C的釋放，同時caspase酶活性檢測到caspase-3、8、9酶活性都有明顯提升，驗證了Ad-HP和Ad-HN是通過激活caspase相關(guān)酶來誘導(dǎo)細胞凋亡，實現(xiàn)對人胃癌細胞SGC7901的抑制作用的。

小鼠瘤內(nèi)注射重組腺病毒結(jié)果表明，Ad-HP和Ad-GP治療組瘤體生長速度明顯減慢，平均生存期顯著延長。同時Ad-HP和Ad-HN能上調(diào)IL-2和IFN-γ等細胞因子水平，表明其能活化NK細胞，刺激免疫活性，顯示重組腺病毒Ad-HP是在抑制腫瘤細胞增殖同時刺激其發(fā)揮免疫作用來進行基因治療腫瘤的。

綜上所述，Ad-HP重組腺病毒能通過誘導(dǎo)人胃癌細胞凋亡進而抑制腫瘤生長，其對用基因治療腫瘤提供理論基礎(chǔ)，并具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

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[收稿2015-09-30修回2015-10-20]

(編輯許四平)

Anti-tumor effects of recombinant adenovirus Ad-HP on gastric cancer

ZHAOJin,LIXi,LIYi-Quan,ZHOUYe,CHENShuang,LANTian,FANYuan-Yuan,LIXiao,JINNing-Yi.

SchoolofChemistryandLifeScience,ChangchunUniversityofTechnology,Changchun130012,China

[Abstract]Objective:To investigate the anti-tumor effects of a recombinant adenovirus Ad-HP that express HN protein on human gastric cancer cell proliferation in vitro and in vivo.Methods: In vitro,infection with Ad-HP could inhibit the proliferation of SGC7901,cell viability was assessed by MTS assay，Annexin V assay，Caspase assay and Western blot were used to reveal the suppression apoptosis method and pathway of Ad-HP on SGC7901 cells.In vivo,BALB/c nude mice were treated via intratumoral injection of Ad-HP to investigate the anti-tumor effects.Results: In vitro,Ad-HP significantly suppressed SGC7901 proliferation,and depended on the treat time and treat dose.The infection of Ad-HP resulted in the upregulation of caspase enzymes ,and release of Cytochrome C.In vivo,Ad-HP could significantly delay tumor growth and prolong the mean survival of model animals;Ad-HP upregulated the cytokines such as IL-2 and IFN-γ prompt immune reaction to Th1.Conclusion: The oncolytic adenovirus Ad-HP could inhibit proliferation of gastric cancer cells and growth of tumors.

[Key words]Human gastric carcinoma cell;Oncolytic adenovirus;NDV;PEG-3

中圖分類號R373.2+1

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)03-0362-05

作者簡介：趙津(1986-)，女，碩士，主要從事分子病毒學(xué)研究。通訊作者及指導(dǎo)教師：金寧一(1956-)，男，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事分子病毒學(xué)研究，E-mail: ningyik@126.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.015

①軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長春130122。

②吉林省腫瘤醫(yī)院頭頸外科，長春130012。