呂　璐　鄭源強(qiáng)　張精彩　李斯琦　王曉東　尹　星　徐　佳　韓新榮　石艷春

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)自治區(qū)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010058)

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六味地黃丸對(duì)自發(fā)性2型糖尿病模型小鼠胰島素表達(dá)水平的影響①

呂璐鄭源強(qiáng)張精彩②李斯琦②王曉東②尹星②徐佳②韓新榮②石艷春

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)自治區(qū)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010058)

[摘要]目的：探討不同劑量六味地黃丸對(duì)自發(fā)性2型糖尿病模型小鼠血清和胰島內(nèi)胰島素表達(dá)水平的影響。方法：將6～8周齡自發(fā)性2型糖尿病模型小鼠(KK-Ay小鼠)隨機(jī)分3組(無藥對(duì)照組、低劑量組、高劑量組)，C57BL/6J小鼠作為遺傳對(duì)照組，各組小鼠分別給予蒸餾水或六味地黃丸灌胃15周。每周測(cè)定空腹血糖、體質(zhì)量、攝食量；給藥15周后，ELISA法測(cè)定小鼠外周血血清胰島素含量，免疫熒光法和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胰島中胰島素表達(dá)水平，比較各組檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果：六味地黃丸給藥后，KK-Ay小鼠空腹血糖降低，體質(zhì)量和攝食量得到控制；給藥組小鼠血清胰島素含量和胰島內(nèi)胰島素表達(dá)水平明顯降低，且低劑量組的降低程度比高劑量組更明顯。結(jié)論：六味地黃丸對(duì)自發(fā)性2型糖尿病模型小鼠高血糖、肥胖、胰島素抵抗具有一定的治療作用，且低劑量組降低血清和胰島內(nèi)胰島素水平的效果優(yōu)于高劑量組。

[關(guān)鍵詞]六味地黃丸；自發(fā)性2型糖尿?。粍?dòng)物模型；胰島素抵抗；胰島素

六味地黃丸初記于《小兒藥證直訣》，由熟地黃、山萸肉、山藥、澤瀉、牡丹皮、茯苓六味藥組成，主治腎陰虛。近年研究表明，六味地黃丸具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、降血壓、降血糖、抗脂質(zhì)過氧化損傷等功效[1，2]。糖尿病已經(jīng)成為威脅人類健康的非傳染性疾病之一，國際糖尿病聯(lián)盟統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示：2011年全球糖尿病人數(shù)已達(dá)到3.7億，其中大多分布于發(fā)展中國家[3]，預(yù)計(jì)2035年全球?qū)⒂薪?.31億糖尿病患者[4]。目前認(rèn)為2型糖尿病是一種天然免疫和慢性亞臨床炎癥疾病，該病及其并發(fā)癥的發(fā)生與機(jī)體低度炎癥密切相關(guān)。炎癥會(huì)影響胰島B細(xì)胞功能，當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí)全身組織會(huì)產(chǎn)生胰島素抵抗現(xiàn)象[5-8]。臨床實(shí)踐中，六味地黃丸常用于糖尿病及其并發(fā)癥的輔助治療。本研究旨在探討不同劑量六味地黃丸對(duì)自發(fā)性2型糖尿病模型小鼠的治療作用尤其是對(duì)血清胰島素含量和胰島組織中胰島素表達(dá)水平的影響，為更好地了解六味地黃丸對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥的治療效果和作用機(jī)制提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組自發(fā)性2型糖尿病模型小鼠(SPF級(jí)KK-Ay小鼠，雌性)24只，6～8周齡，隨機(jī)分為3組，每組8只，即無藥對(duì)照組、低劑量組和高劑量組。C57BL/6J小鼠8只，6～8周齡。KK-Ay小鼠和C57BL/6J小鼠的體質(zhì)量均為18～20 g/只。購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0004。C57BL/6J小鼠作為遺傳對(duì)照組，即正常組。高糖飼料：購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2009-0008。

1.1.2主要試劑及儀器濃縮六味地黃丸[北京同仁堂(集團(tuán))有限責(zé)任公司]，小鼠血清胰島素ELISA試劑盒(RD Systems)，anti-insulin單克隆抗體(BD公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗兔IgG二抗(Sigma公司)，封閉液(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，DAB試劑盒(武漢博士得生物工程有限公司)。主要儀器：ZEISS Axio observer Z1活細(xì)胞工作站，Olympus圖像采集分析系統(tǒng)等。

1.2方法

1.2.1小鼠灌胃給藥并監(jiān)測(cè)平均空腹血糖、體質(zhì)量及平均攝食量變化各組小鼠購買后先進(jìn)行2周適應(yīng)性飼養(yǎng)，并全程給予高糖飼料。第3周開始灌胃給藥，各組每只小鼠灌胃0.1 ml/次，2次/日。六味地黃丸用無菌蒸餾水配成混懸液，低劑量組和高劑量組的給藥濃度分別為70和140 mg/ml(按照濃縮六味地黃丸藥品說明書并根據(jù)開始灌胃時(shí)全部小鼠平均體重為37.51 g，綜合換算給藥量。140 mg/ml是按正常成人給藥劑量換算而得，70 mg/ml為減半給藥劑量)；無藥組和遺傳對(duì)照組給予同劑量無菌蒸餾水。每周一晚23∶00撤除飼料，次日早上7∶00測(cè)空腹血糖、體質(zhì)量，計(jì)算平均攝食量。

1.2.2小鼠血清胰島素含量檢測(cè)灌胃給藥15周后，每組隨機(jī)抽取2只小鼠摘眼球取非抗凝外周血，37℃靜置30 min析出血清后，1 500 r/min離心5 min，收集血清后-20℃保存。ELISA法檢測(cè)小鼠血清胰島素含量，操作步驟根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行，每個(gè)樣本設(shè)2個(gè)復(fù)孔。

1.2.3免疫熒光法和免疫組織化學(xué)法觀察小鼠胰腺組織學(xué)變化(1)免疫熒光法:胰腺組織蠟塊切片成4 μm厚度的石蠟帶，用防脫載玻片撈片，烤片、脫蠟、水化后，經(jīng)抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性、封閉液封閉后，滴加一抗(即胰島素抗體)，4℃過夜，二抗(即FITC標(biāo)記羊抗兔IgG二抗)室溫孵育1 h，用DAPI對(duì)細(xì)胞核染色3 min，水溶性封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。(2)免疫組織化學(xué)法:按照常規(guī)方法及DAB試劑盒說明書操作。

2結(jié)果

2.1各組小鼠平均空腹血糖、體質(zhì)量及平均攝食量變化

2.1.1平均血糖值變化高劑量組小鼠的平均血糖在第1～3周直線升高，在第3周后下降，之后在遺傳對(duì)照組(血糖正常組)平均血糖波動(dòng)區(qū)間波動(dòng)。低劑量組小鼠的血糖在第1～3周也升高，增長斜率低于高劑量組，給藥后2周仍有小幅度升高，隨后下降，于給藥4周后降到遺傳對(duì)照組(血糖正常組)平均血糖波動(dòng)區(qū)間并相對(duì)平穩(wěn)波動(dòng)。無藥對(duì)照組小鼠的血糖在第1～3周升高(與高劑量組小鼠平均血糖值相近)后仍維持高水平狀態(tài)，之后以高于低劑量組和高劑量組小鼠的平均血糖值的狀態(tài)波動(dòng)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析組間比較采用單因素方差分析：F=2.81，P=0.046<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；采用LSD檢驗(yàn)結(jié)果表明：高劑量、低劑量組、遺傳對(duì)照組小鼠的平均血糖水平與無藥對(duì)照組均有差異(P值分別為0.011、0.030、0.034，均<0.05)，高劑量組與低劑量組小鼠平均血糖值之間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.699>0.05)。結(jié)果如圖1所示，說明六味地黃丸可以降低糖尿病模型小鼠的血糖水平。

2.1.2平均體質(zhì)量變化遺傳對(duì)照組小鼠平均體質(zhì)量變化呈平直線，其余各組小鼠均在第1～3周升高，之后維持在高水平狀態(tài)，且高劑量組和無藥對(duì)照組小鼠的平均體質(zhì)量變化相近，以高于低劑量組小鼠平均體質(zhì)量的水平變化。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析組間比較采用單因素方差分析：F=283.78，P=0.000<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且差異顯著；采用LSD檢驗(yàn)結(jié)果表明：低劑量組小鼠的平均體質(zhì)量變化與高劑量組和無藥對(duì)照組均具有顯著差異(P值均為0.000，均<0.01)。結(jié)果如圖2所示，提示低劑量給藥方案對(duì)小鼠體質(zhì)量的控制效果優(yōu)于高劑量組。

2.1.3平均攝食量變化無藥對(duì)照組和遺傳對(duì)照組小鼠的平均攝食量波動(dòng)范圍較大；高劑量組小鼠在給藥5周前波動(dòng)較大，之后在略高于低劑量組的水平以小幅度波動(dòng)；低劑量組在給藥后波動(dòng)范圍小。

低劑量組小鼠的平均攝食量低于無藥對(duì)照組和高劑量組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(采用兩個(gè)獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)，Z值分別為-2.073和-2.972，P分別為0.038和0.003)；高劑量組和無藥對(duì)照的平均攝食量差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(采用兩個(gè)獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)，Z=-1.060，P=0.289)。結(jié)果如圖3所示，說明低劑量給藥方案對(duì)小鼠攝食量的控制效果優(yōu)于高劑量組。

圖1　各組小鼠飼養(yǎng)18周平均血糖含量比較Fig.1　Concentrations of fast blood glucose in different groups of mice in 18 weeks

2.2血清胰島素含量的變化各組小鼠胰島素ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示：無藥對(duì)照組明顯高于其余各組，呈高胰島素血癥樣；低劑量組和高劑量組均高于遺傳對(duì)照組，且低劑量組胰島素水平低于高劑量組，結(jié)果如圖4所示，表明六味地黃丸可以降低自發(fā)性2型糖尿病小鼠的血清胰島素水平。

圖2　各組小鼠飼養(yǎng)18周平均體質(zhì)量變化Fig.2　Average body weight in different groups of mice in 18 weeks

圖3　各組小鼠飼養(yǎng)18周平均攝食量比較Fig.3　Average food consumptions in different groups of mice in 18 weeks

圖4　各組小鼠血清胰島素含量Fig.4　Insulin concentrations in sera from different groups of miceNote: **.P<0.01; *.P<0.05.1.No drug control;2.Hight-dose；3.Low-dose；4.Genetic control.

圖5　免疫熒光法檢測(cè)小鼠胰腺組織胰島素表達(dá)水平(×100)Fig.5　Immunofluorescence results of pancreases from different groups' mice(×100)Note: A. No drug control group; B. High-dose group; C. Low-dose group; D. Genetic control group; E.PBS control.

圖6　免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠胰腺組織胰島素表達(dá)水平(×100)Fig.6　Immunohistochemistry results of pancreases from different groups′ mice(×100)Note: A. No drug control group; B.High-dose group; C.Low-dose group; D.Genetic control group; E.PBS control.

2.3胰島組織中胰島素表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果由免疫熒光法和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果可以看出，無藥對(duì)照組小鼠胰島中胰島素水平很高，明顯高于其余各組；低劑量組小鼠胰島中胰島素表達(dá)水平低于高劑量組，見圖5、6。

3討論

糖尿病(DM)尤其是2型糖尿病已成為威脅我國人民生命健康的最重要非傳染性疾病之一，但確切的發(fā)病機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究，糖尿病的遷延不愈及長期用藥導(dǎo)致的機(jī)體病變成為目前比較棘手的問題。六味地黃丸是中醫(yī)治療該病的代表方劑之一，臨床上廣泛用于糖尿病及其并發(fā)癥的輔助治療。KK-Ay小鼠作為典型的自發(fā)性2型糖尿病模型小鼠，于1957年由日本學(xué)者通過植入黃色肥胖基因(Ay基因)到KK/Ta鼠后培育而成，該小鼠通常被認(rèn)為是一種多基因疾病模型，其自發(fā)表現(xiàn)出高血糖、糖耐量異常、高胰島素血癥、輕度肥胖癥，與人的發(fā)病特征相似[9]。本研究所用雌性KK-Ay鼠均于10～12周齡左右出現(xiàn)體質(zhì)量增加、血糖升高，出現(xiàn)典型的2型糖尿病癥狀，而遺傳對(duì)照組C57BL/6J小鼠未出現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：無藥對(duì)照組小鼠的血糖明顯高于其余各組，說明六味地黃丸具有降血糖的功效，高、低劑量組對(duì)血糖的影響差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療組小鼠血清胰島素和胰島內(nèi)胰島素含量顯著降低，且六味地黃丸延緩了小鼠血糖升高程度及高血糖的出現(xiàn)。上述結(jié)果提示，六味地黃丸有助于控制血糖、降低胰島素表達(dá)，可能具有促進(jìn)胰島素與臟器作用，增加臟器對(duì)胰島素的敏感性，從而減輕KK-Ay小鼠高胰島素血癥樣癥狀。杜華等研究結(jié)果也提示六味地黃丸能夠改善OLEFT大鼠肝臟胰島素抵抗[10]。此外，通過每周對(duì)小鼠體質(zhì)量和攝食量的觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療組小鼠的體質(zhì)量、攝食量均得到較好的控制，且低劑量組效果好于高劑量組。

本實(shí)驗(yàn)探討了六味地黃丸對(duì)KK-Ay小鼠的治療作用尤其是對(duì)血清胰島素含量和胰島組織中胰島素表達(dá)水平的影響，并對(duì)藥物劑量進(jìn)行了比較研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了六味地黃丸對(duì)KK-Ay小鼠具有明顯的治療作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)低劑量組的綜合治療效果達(dá)到甚至優(yōu)于高劑量組。中醫(yī)講究辯證施治，針對(duì)糖尿病病程、主要臨床癥狀、累及主要臟器及其損傷程度等進(jìn)行差異化治療。本研究進(jìn)一步提示六味地黃丸對(duì)2型糖尿病的治療作用可能與其具有降低血糖、降低胰島素表達(dá)等相關(guān)，同時(shí)給藥劑量與治療效果之間存在相關(guān)性，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)指導(dǎo)臨床用藥具有一定的參考價(jià)值。

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[收稿2015-11-06修回2016-02-03]

(編輯許四平)

Effects of Liuweidihuang pill on insulin levels in sera and pancreatic islets from spontaneous mouse models of human type 2 diabetes administrated with different doses

LüLu,ZHENGYuan-Qiang,ZHANGJing-Cai,LISi-Qi,WANGXiao-Dong,YINXing,XUJia,HANXin-Rong,SHIYan-Chun.

InnerMongoliaKeyLaboratoryofMolecularBiology,InnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010058,China

[Abstract]Objective:To investigate the effects of Liuweidihuang pill on the insulin levels in sera and pancreatic islets from spontaneous mouse models of human type 2 diabetes administrated with different doses.Methods: The 6-8 week-old KK-Ay mice were randomly divided into three groups including no drug control group,low-dose group and high-dose group,in addition C57BL/6J mice were used as a genetic control group.All the animals were given with different dose Liuweidihuang pill solutions or sterile distilled water by intragastrical administration for fifteen weeks.The fasting blood glucose,body mass and food consumption were measured weekly.The serum insulin levels were surveyed by ELISA.And the insulin levels in the pancreas islets were detected by immunofluorescence and immunohistochemistry.Results: Decreased fasting blood glucose,controlled body mass and food consumption,and lower levels of insulin in the sera and pancreas islets were confirmed from the KK-Ay mice administered with Liuweidihuang pill.Furthermore,the low dose program exhibits a stronger effect.Conclusion: Liuweidihuang pill has exhibited relatively therapeutic effects in the spontaneous type 2 diabetes mice including controls of hyperglycemia and body mass and relieving insulin resistance.In addition,the low-dose regimen showed even better treatment in controlling insulin levels in the sera and pancreas islets.

[Key words]Liuweidihuang pill;Spontaneous type 2 diabetes;Animal model;Insulin resistance;Insulin

中圖分類號(hào)R967

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)03-0350-04

作者簡介：呂璐(1988年-)，女，主要從事抗感染免疫與中藥免疫研究，E-mail: 805614039@qq.com。通訊作者及指導(dǎo)教師：石艷春(1958年-)，女，教授，主要從事抗感染免疫與疫苗研究，E-mail: ycshi5388@163.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.012

·中醫(yī)中藥與免疫·

①本文為內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金(2012MS1126)，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)英才培育項(xiàng)目資助。

②內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，呼和浩特010058。

韓新榮(1957年-)，男，教授，主要從事中醫(yī)藥與免疫學(xué)研究工作。