賈　娜　武俏麗　紀(jì)　勇　徐小林

(天津醫(yī)科大學(xué)，天津300070)

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促吞噬肽(Tuftsin)在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠中的神經(jīng)功能改善作用①

賈娜武俏麗②紀(jì)勇②徐小林②

(天津醫(yī)科大學(xué)，天津300070)

[摘要]目的：探索促吞噬肽(Tuftsin)在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠模型中的神經(jīng)功能改善作用。方法：用髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55(MOG35-55)免疫C57BL/6小鼠，應(yīng)用微量注射泵皮下緩慢注射500 μmol/L Tuftsin。每天對(duì)各組小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，免疫后28 d處死各組小鼠并取其腦和脊髓組織，觀(guān)察并比較各組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)部位及程度、有無(wú)脫髓鞘及脫失程度，以及比較各組 IL-10和TNF-α的表達(dá)情況。結(jié)果：①Tuftsin干預(yù)組小鼠發(fā)病率比EAE模型組低，平均神經(jīng)功能評(píng)分小于EAE模型組(P<0.05)。②Tuftsin干預(yù)組較EAE模型組炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)程度和髓鞘的脫失程度及范圍減輕(P<0.05)。③Tuftsin干預(yù)組的IL-10的表達(dá)量比EAE模型組高(P<0.05)，TNF-α的表達(dá)比EAE模型組低。結(jié)論：Tuftsin通過(guò)降低炎性反應(yīng)、增強(qiáng)抗炎作用在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮保護(hù)功能，降低EAE模型小鼠的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及脫髓鞘程度，減緩EAE小鼠的癥狀、促進(jìn)其神經(jīng)功能的恢復(fù)。

[關(guān)鍵詞]多發(fā)性硬化;實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎;促吞噬肽

多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis,MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)最常見(jiàn)的慢性炎癥性脫髓鞘疾病，由于免疫系統(tǒng)攻擊髓鞘導(dǎo)致軸索及神經(jīng)元的退行性病變。其病理特征是血管周?chē)仔圆∽儭⑺枨势茐?、星型?xì)胞增殖、少突膠質(zhì)細(xì)胞和軸索缺失。目前多發(fā)性硬化的機(jī)制尚未完全明了，在一項(xiàng)關(guān)于EAE和MS最新研究動(dòng)向的綜述中提出，EAE是由Th1細(xì)胞免疫介導(dǎo)的器官特異性自身免疫病。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是由CD4+T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘改變的自身免疫性疾病，是MS的理想動(dòng)物模型[1]。

Tuftsin[2]是一種天然的促吞噬肽，由蘇-賴(lài)-脯-精(Thr-Lys-Pro-Arg)四種氨基酸組成。1970年Najjar和Nishioka[2]首次描述了其特點(diǎn)，Tuftsin能夠促進(jìn)單核細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞的吞噬活性，如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等，作用機(jī)制與這些細(xì)胞表面存在Tuftsin受體有關(guān)，同時(shí)Tuftsin還具有抗炎、抗腫瘤等作用[3-5]。國(guó)外有實(shí)驗(yàn)證明，Tuftsin及其類(lèi)似物可以通過(guò)化學(xué)合成的方法獲得，并廣泛的應(yīng)用于臨床研究[6]。既往有研究通過(guò)體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)得出Tuftsin可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的活性。而T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在過(guò)去被認(rèn)為在EAE小鼠神經(jīng)元和軸索退行性病變的過(guò)程中起到關(guān)鍵作用[7]。

因此研究Tuftsin在EAE小鼠中可能發(fā)揮的作用可以為MS的臨床實(shí)驗(yàn)研究提供一種新的治療靶點(diǎn)及策略。國(guó)外有少量該方面的報(bào)道，證實(shí)Tuftsin通過(guò)改變T淋巴細(xì)胞或單核細(xì)胞的免疫表型，從而對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮保護(hù)作用。但是具體的機(jī)制目前還未完全明確，且目前國(guó)內(nèi)尚未有相關(guān)的研究。本研究通過(guò)微量注射泵將Tuftsin緩慢注射于EAE小鼠皮下，著重觀(guān)察及比較其與EAE模型組的臨床神經(jīng)功能評(píng)分及組織病理染色結(jié)果。

1材料與方法

1.1材料8～10周，體重約20 g的雌性C57BL/6小鼠共30只，購(gòu)自北京華阜康生物技術(shù)有限公司。30只C57BL/6小鼠共分為3組，即正常對(duì)照組、EAE模型組、Tuftsin干預(yù)組。鼠源MOG35-55多肽及Tuftsin由南京金斯瑞基因技術(shù)公司合成，純度≥98%。弗氏完全佐劑(CFA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；滅活結(jié)核菌素桿菌(TB)購(gòu)自美國(guó)Difco公司；百日咳毒素(PTX)購(gòu)自美國(guó)List Biological Laboratories公司。提取總RNA試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche公司。

1.2方法

1.2.1EAE模型的建立及分組EAE組以200 μg MOG35-55溶入200 μl PBS緩沖液，再與200 μl CFA充分混合成乳劑(滅活結(jié)核菌素桿菌終濃度為5 mg/ml)，正常對(duì)照組則直接將200 μl PBS與200 μl CFA充分混合。200 μg乳劑于小鼠背部分兩點(diǎn)皮下注射。分別于免疫后0 h及48 h腹腔注射500 ng PTX。 EAE模型建立后第1天用微量注射泵將500 μmol/L Tuftsin 20 μl緩慢注射于小鼠背部皮下，連續(xù)10 d，共200 μl[8]，制成Tuftsin干預(yù)組。

1.2.2各組實(shí)驗(yàn)小鼠神經(jīng)功能評(píng)分免疫后每天對(duì)各組實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，連續(xù)觀(guān)察28 d。神經(jīng)功能評(píng)分按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[9]：0分為無(wú)癥狀；1分為尾巴張力下降(完全無(wú)力，尾巴尖端不能卷曲)或后肢無(wú)力(步態(tài)不穩(wěn))；2分為尾部和后肢無(wú)力；3分為后肢癱瘓(單側(cè)或雙側(cè)后肢一定程度上可以運(yùn)動(dòng))；4分為后肢完全癱瘓(后肢完全不能運(yùn)動(dòng)或前肢拖動(dòng)后肢運(yùn)動(dòng))；5分為死亡。

1.2.3組織病理學(xué)觀(guān)察各組取4只實(shí)驗(yàn)組小鼠在免疫后第28天采用心臟灌注法處死，4%多聚甲醛灌注后，快速取出脊髓組織，放入4%多聚甲醛中固定。脊髓組織用石蠟包埋連續(xù)切片，切片厚度為5 μm，脊髓頸及腰段取橫切面分別進(jìn)行蘇木素-伊紅染色、快藍(lán)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察脊髓組織的形態(tài)、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)部位及程度、髓鞘脫失的情況。

1.2.4實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)應(yīng)用RT-PCR法定量測(cè)定各組小鼠腦組織內(nèi)IL-10 及TNF-α的表達(dá)情況。各組取6只實(shí)驗(yàn)小鼠在免疫后第28天分別處死，迅速取出各組腦組織放入液氮中滅活RNA酶。采用OMAGA總RNA提取試劑盒按說(shuō)明書(shū)操作從各組腦組織中提取總RNA；采用Invitrogen反轉(zhuǎn)錄試劑盒按說(shuō)明書(shū)操作將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Roche的定量試劑盒進(jìn)行定量檢測(cè)。定量過(guò)程中條件為：95℃反應(yīng)5 min；變性、擴(kuò)增和延伸分別為95℃反應(yīng) 20 s，62℃(IL-10)或60℃(TNF-α)反應(yīng)20 s，72℃反應(yīng)20 s，共50個(gè)循環(huán)。72℃反應(yīng)5 min。使用GAPDH作為內(nèi)參校正。所用引物為：GAPDH、TNF-α、IL-10，均為小鼠來(lái)源。引物序列為：GAPDH:Forward：5′-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3′，Reverse：5′-GGCATGGACTGTGGT-CATGA-3′；TNF-α：Forward：5′-CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA-3′，Reverse：5′-TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC-3′；IL-10：Forward：5′-TGGCCACACTTGAGAGCTGC-3′，Reverse：5′-TTCAGGGATGAAGCGGCTGG-3′。

2結(jié)果

2.1發(fā)病情況通過(guò)觀(guān)察發(fā)現(xiàn)：正常對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)小鼠均未發(fā)病，EAE模型組發(fā)病率為100%，Tuftsin干預(yù)組發(fā)病率為60%，各組死亡率均為0%，采用Fisher精確檢驗(yàn)比較三組發(fā)病率，正常對(duì)照組與EAE模型組及Tuftsin干預(yù)組比較均有顯著差異，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；EAE模型組發(fā)病率與Tuftsin干預(yù)組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。統(tǒng)計(jì)兩組發(fā)病小鼠的起病時(shí)間：EAE模型組平均起病時(shí)間為(17.5±1.67)d，Tuftsin干預(yù)組小鼠為(14.6±1.29)d，兩組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。比較兩組發(fā)病小鼠的平均神經(jīng)功能評(píng)分，EAE模型組發(fā)病小鼠的平均神經(jīng)功能評(píng)分為(2.00±0.71)分，Tuftsin干預(yù)組為(0.80±0.44)分，Tuftsin干預(yù)組發(fā)病小鼠的平均神經(jīng)功能評(píng)分低于EAE模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。各組患病小鼠表現(xiàn)特點(diǎn)為：精神萎靡，毛色暗淡，尾巴張力消失，體重下降，后肢癱瘓，個(gè)別小鼠表現(xiàn)為步態(tài)不穩(wěn)。各組實(shí)驗(yàn)小鼠發(fā)病情況見(jiàn)表1。

2.2組織病理染色結(jié)果

2.2.1蘇木素-伊紅染色(HE染色)光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察各組脊髓組織的HE染色，正常對(duì)照組脊髓HE染色結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；EAE模型組脊髓組織的HE染色顯示組織結(jié)構(gòu)疏松，在白質(zhì)區(qū)內(nèi)可見(jiàn)不同程度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，在小血管旁偶可見(jiàn)到淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞環(huán)繞，偶爾可見(jiàn)到小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，亦可見(jiàn)到神經(jīng)元的變性；Tuftsin干預(yù)組脊髓組織內(nèi)可見(jiàn)到類(lèi)似EAE模型組的改變，但炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的程度及范圍較EAE模型組有不同程度的減少。見(jiàn)圖2。

2.2.2髓鞘染色(Luxol fast blue染色,LFB)正常對(duì)照組脊髓組織LFB染色未見(jiàn)到髓鞘脫失；EAE模型組脊髓組織LFB染色可見(jiàn)到白質(zhì)疏松，片狀的髓鞘脫失、不連續(xù)，有的呈空泡樣改變；LFB染色在Tuftsin干預(yù)組脊髓組織內(nèi)亦可見(jiàn)到白質(zhì)疏松，髓鞘淡染、不連續(xù)及脫失；Tuftsin干預(yù)組髓鞘脫失的程度及范圍小于EAE模型組，見(jiàn)圖2。

NamenIncidencerate(%)NeurologicalscoresTimeofonset(d)Controlgroup1000.00±0.000.00±0.00EAEgroup101001)2.00±0.711)17.5±1.671)Tuftsingroup10601)2)0.80±0.441)2)14.6±1.291)2)

Note：Comparison with Control group，1)P<0.05;Comparison with EAE group，2)P<0.05.

圖1　各組實(shí)驗(yàn)小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的平均神經(jīng)功能評(píng)分Fig.1　Neurological scores of each group at different stage after immunization

2.3實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果

2.3.1IL-10的表達(dá)變化使用RT-PCR法測(cè)得各組小鼠腦組織的TNF-α和IL-10在免疫后第28天的表達(dá)含量見(jiàn)表2、圖3，可以看出；正常對(duì)照組小鼠的腦組織內(nèi)也有少量IL-10和TNF-α的表達(dá)。EAE模型組小鼠IL-10在免疫后第28天的表達(dá)量與正常對(duì)照組相比表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Tuftsin干預(yù)組小鼠腦組織內(nèi)IL-10的表達(dá)在免疫后第28天與EAE模型組相比明顯升高且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其升高幅度為2.97倍。

圖2　各組實(shí)驗(yàn)小鼠在免疫后第28天的HE染色和LFB染色(×200)Fig.2　HE stain and LFB stain of each group at 28th days after immunization(×200)

NamenIL-10TNF-αControlgroup60.0052±0.00130.0091±0.0039EAEgroup60.0288±0.00901)0.0354±0.01271)Tuftsingroup60.0702±0.01611)2)0.0152±0.00592)

Note：Comparison with Control group，1)P<0.05；Comparison with EAE group,2)P<0.05.

圖3　各組實(shí)驗(yàn)小鼠腦組織內(nèi)IL-10 及TNF-α的表達(dá)Fig.3　mRNA expression of IL-10，TNF-α by brian tissue of each group

2.3.2TNF-α的表達(dá)EAE模型組小鼠腦組織的TNF-α的表達(dá)與IL-10類(lèi)似，免疫后第28天的表達(dá)與正常對(duì)照組比較差異較大，其明顯高于正常對(duì)照組。Tuftsin干預(yù)組小鼠在免疫后第28天TNF-α的表達(dá)量高于正常對(duì)照組，相較于EAE模型組明顯下降，下降幅度約為0.430倍，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2、圖3。

3討論

國(guó)外有研究表明Tuftsin可以改善EAE小鼠的癥狀、促進(jìn)其神經(jīng)功能的恢復(fù)。我們的研究通過(guò)給EAE小鼠用微量注射泵皮下緩慢注射Tuftsin，著重于比較EAE模型組與Tuftsin干預(yù)組兩組的神經(jīng)功能評(píng)分和組織病理染色結(jié)果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①Tuftsin干預(yù)組的發(fā)病率低于EAE模型組；②Tuftsin干預(yù)組的神經(jīng)功能評(píng)分與EAE模型組相比明顯降低且癥狀較輕；③組織病理染色結(jié)果顯示Tuftsin干預(yù)組的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及脫髓鞘的程度較EAE模型組減輕。因此，我們推測(cè)Tuftsin可以改善EAE小鼠的臨床神經(jīng)功能癥狀及脫髓鞘的程度，這與國(guó)外相關(guān)報(bào)道結(jié)論一致。另外本研究發(fā)現(xiàn)Tuftsin干預(yù)組比EAE模型組的初次發(fā)病時(shí)間延遲。因此我們推測(cè)是否Tuftsin在EAE病程的早期就開(kāi)始發(fā)揮作用，國(guó)內(nèi)目前還未見(jiàn)這方面相關(guān)的報(bào)道，這也是我們進(jìn)一步研究的方向。

近年來(lái)Joanna Mikita等[10]的一項(xiàng)研究提出：通過(guò)改變EAE模型中單核細(xì)胞M1/M2的活性模式，能夠改善EAE的臨床癥狀。Bhasin等[8]的研究同樣證實(shí)Tuftsin通過(guò)激活小膠質(zhì)細(xì)胞可以減輕EAE小鼠的癥狀，并且能夠促進(jìn)其神經(jīng)功能的恢復(fù)。隨后他們又提出Tuftsin能夠促進(jìn)Th1向Th2的轉(zhuǎn)化從而減輕EAE的癥狀。本研究結(jié)果顯示，免疫后28天Tuftsin干預(yù)組TNF-α的表達(dá)量比EAE模型組降低，而IL-10的表達(dá)量比EAE模型組高，推測(cè)這可能與T淋巴細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的免疫表型發(fā)生改變有關(guān)。類(lèi)似的研究也證實(shí)了這一觀(guān)點(diǎn)，Wu等[11]通過(guò)建立EAE小鼠模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以及體外培養(yǎng)T細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞的研究表明Tuftsin能夠下調(diào)Th1的炎性作用、上調(diào)TH2的抗炎作用以及Treg細(xì)胞的作用從而發(fā)揮作用改善EAE的癥狀，促進(jìn)其神經(jīng)功能的恢復(fù)。1995年Khoruts等[12]的研究提出Th2型反應(yīng)能夠抑制EAE和MS的病情發(fā)展。最近在關(guān)于炎癥性腸病動(dòng)物模型和狼瘡腎炎動(dòng)物模型的研究中也得出了同樣的結(jié)論，Tuftsin-PC能夠下調(diào)促炎因子 IL-1β、TNF-α和IL-17的表達(dá)，相反增加抗炎因子IL-10的表達(dá)，從而能夠防止實(shí)驗(yàn)小鼠腸炎和狼瘡腎炎的發(fā)生[13,14]。本研究也支持這種可能的機(jī)制：Tuftsin能夠改變T淋巴細(xì)胞的免疫表型，通過(guò)提高Th2的抗炎作用、分泌保護(hù)性因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)揮保護(hù)性作用，從而改善EAE小鼠的神經(jīng)功能。

Tuftsin能夠促進(jìn)單核細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞吞噬活性，如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等，小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞。激活狀態(tài)下，小膠質(zhì)細(xì)胞具有抗原提呈作用，在EAE的發(fā)病過(guò)程中，小膠質(zhì)細(xì)胞激活免疫反應(yīng)，參與疾病的發(fā)生，另外小膠質(zhì)細(xì)胞還可以分泌一些有害的細(xì)胞因子參與MS的發(fā)病[15]。但是近年來(lái)有報(bào)道小膠質(zhì)細(xì)胞具有雙重作用，在發(fā)揮有害作用的同時(shí)也對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮保護(hù)作用[16,17]。Bhasin等[8]的研究表明Tuftsin通過(guò)激活小膠質(zhì)細(xì)胞可以減輕EAE小鼠的癥狀，并且可以促進(jìn)其神經(jīng)功能的恢復(fù)。本研究結(jié)果顯示：Tuftsin可以降低EAE小鼠脫髓鞘及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的程度，改善EAE小鼠的神經(jīng)功能，推測(cè)可能與促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞活性有關(guān)。

Tuftsin的促吞噬活性作用，尤其是對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的作用，使它成為一種潛在的免疫治療靶向，可以為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

4結(jié)論

Tuftsin在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)能夠發(fā)揮保護(hù)作用，降低EAE模型小鼠的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及脫髓鞘程度，減緩EAE小鼠的癥狀、促進(jìn)其神經(jīng)功能的恢復(fù)。

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[收稿2015-07-25修回2015-08-21]

(編輯倪鵬)

Tuftsin can attenuates symptoms in experimental autoimmune encephalo-myelitis mouse

JIANa,WUQiao-Li,JIYong,XUXiao-Lin.

TiangjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China

[Abstract]Objective:To explore whether Tuftsin can attenuates symptoms in experimental autoimmune encephalomyelitis mouses.Methods: C57BL/6 mice were immunized with MOG35-55 peptides,and evaluated for clinical neurological score every day.10 mice of the EAE were injected with Tuftsin subcutaneously.The spinal cord were stained by the methods of Haematoxylin Eosinstain,Luxol Fast Blue stain.The mRNA expression of IL-10 and TNF-α from brian tissue were detected at the 28 days by RT-PC method.Results: The controlled mice had no symptoms of disease and HE,LFB were normal.Comparison EAE group with Tuftsin group of HE,LFB,EAE group were server than Tuftsin group.The expression of IL-10 in Tuftsin group was higher than EAE group.The expression of TNF-α in Tuftsin group was lower than EAE group.Conclusion: Tuftsin can attenuates symptoms in experimental autoimmune encephalomyelitis mouses.

[Key words]Multiple sclerosis；Experimental autoimmune encephalomyelitis;Tuftsin

中圖分類(lèi)號(hào)R744.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)03-0323-05

作者簡(jiǎn)介：賈娜(1987年-)，女，在讀碩士，主要從事腦血管病研究，E-mail:Xjunnana@163.com。通訊作者及指導(dǎo)教師：徐小林(1963年-)，男，碩士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事腦血管病的基礎(chǔ)與臨床方面的研究，E-mail：hhyyxxl@163.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.006

①本文為天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃自然科學(xué)基金一般項(xiàng)目(M0101)。

②天津市環(huán)湖醫(yī)院，天津300060。