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蝎毒多肽提取物調(diào)控肝臟移植瘤中自然殺傷細(xì)胞浸潤(rùn)的機(jī)制研究①

韓琛王朝霞賈青王兆朋張?jiān)掠堚曂鹾阈?/p>

(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，濟(jì)南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南250062)

[摘要]目的：觀察蝎毒多肽提取物(PESV)對(duì)H22細(xì)胞小鼠肝臟原位移植瘤模型中腫瘤浸潤(rùn)自然殺傷細(xì)胞(Natural killer cell,NK cell)的浸潤(rùn)分布及活性的影響。方法：C57BL/6小鼠肝臟接種H22肝癌細(xì)胞株懸液構(gòu)建原位移植瘤模型，設(shè)立正常對(duì)照組、荷瘤對(duì)照組、PESV小劑量組和PESV大劑量組，分別給予生理鹽水及PESV灌胃干預(yù)14 d，觀察比較各組小鼠給藥后的腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量及生存期變化，通過(guò)HE染色比較各組腫瘤組織形態(tài)學(xué)變化，流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化檢測(cè)肝臟及癌組織中浸潤(rùn)NK1.1+細(xì)胞的比例及分布特點(diǎn)，real-time PCR法檢測(cè)癌組織中穿孔素、顆粒酶B的表達(dá)。結(jié)果：PESV大、小劑量組肝臟移植瘤的生長(zhǎng)受到抑制，腫瘤體積和瘤質(zhì)量均低于荷瘤對(duì)照組，腫瘤抑制率分別為30.77%和15.38%,生存期觀察顯示PESV大劑量組能顯著延長(zhǎng)荷瘤小鼠生存時(shí)間，生命延長(zhǎng)率為34.06%，P<0.05；荷瘤對(duì)照組腫瘤細(xì)胞排列緊密，異型性顯著，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，PESV大、小劑量組出現(xiàn)明顯壞死區(qū)，細(xì)胞異型性減輕；PESV大劑量組小鼠肝臟NK細(xì)胞占肝臟總淋巴細(xì)胞的比例是(5.91±0.49)%，顯著高于荷瘤對(duì)照組(3.69±0.50)%(P<0.05)，且大量浸潤(rùn)分布在腫瘤組織及癌旁組織中;PESV大劑量組瘤組織中穿孔素和顆粒酶的mRNA表達(dá)量分別是荷瘤對(duì)照組的3.62倍和5.82倍(P<0.05)。結(jié)論：PESV可通過(guò)提高H22細(xì)胞肝臟原位移植瘤中浸潤(rùn)NK細(xì)胞的比例，促進(jìn)NK細(xì)胞向腫瘤組織遷移，誘導(dǎo)穿孔素和顆粒酶B的產(chǎn)生，有助于NK細(xì)胞殺傷活性的恢復(fù)，從而增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的清除，抑制腫瘤的浸潤(rùn)生長(zhǎng)。

[關(guān)鍵詞]蝎毒；肝腫瘤；自然殺傷細(xì)胞；穿孔素；顆粒酶B

自然殺傷(Natural killer cells,NK)細(xì)胞是一類(lèi)胞內(nèi)含有大顆粒、不同于T、B淋巴細(xì)胞的第三類(lèi)淋巴細(xì)胞，是固有免疫系統(tǒng)重要成員之一，在抗感染、抗腫瘤等免疫監(jiān)視過(guò)程中發(fā)揮重要作用，被視為機(jī)體免疫系統(tǒng)的第一道防線[1]。肝臟中含有豐富的NK細(xì)胞，而且其免疫特性表現(xiàn)出器官特異性，活化的NK細(xì)胞可以更好地清除機(jī)體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤的生長(zhǎng)[2]。原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)發(fā)生過(guò)程中，由于腫瘤細(xì)胞表面相關(guān)抗原的改變及微環(huán)境中細(xì)胞因子、免疫細(xì)胞的相互作用，NK細(xì)胞的活性大大降低，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的逃逸。如何提高并恢復(fù)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷效應(yīng)，成為抗腫瘤免疫治療的重要手段[3]。蝎毒多肽提取物(Polypeptide extract from scorpion venom,PESV)是從東亞鉗蝎蝎毒中提取的活性物質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明PESV對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，可抑制腫瘤血管生成、干預(yù)腫瘤免疫逃逸發(fā)生[4]，PESV在抑制腫瘤增殖過(guò)程中是否對(duì)機(jī)體NK細(xì)胞的免疫活性有調(diào)節(jié)作用尚未有相關(guān)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察PESV對(duì)H22細(xì)胞小鼠肝臟原位移植瘤腫瘤組織中NK細(xì)胞的浸潤(rùn)分布及功能的影響，探討PESV對(duì)機(jī)體固有免疫的調(diào)節(jié)作用，為肝癌的免疫治療提供新的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞6～8周C57BL/6 小鼠，雄性，體重20～22 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號(hào) SCXK2014-0004,飼養(yǎng)于山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房IVC(智能型獨(dú)立送回風(fēng)凈化籠具)中，動(dòng)物在室溫(22±2)℃、相對(duì)濕度50%條件下自由攝食飲水，動(dòng)物購(gòu)入適應(yīng)5 d后開(kāi)始試驗(yàn)。鼠源性H22肝癌細(xì)胞株由本室保存，應(yīng)用時(shí)復(fù)蘇后接種于昆明小鼠腹腔內(nèi)，接種三代后取增殖良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2試劑和儀器PESV由本室研制，提取方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[5]，使用時(shí)用無(wú)菌生理鹽水稀釋。Percoll購(gòu)自Solarbio公司，小鼠CD3-FITC(Cat.No.553 061)、NK1.1-PE-CY7(Cat.No.5620 62)標(biāo)記熒光單克隆抗體購(gòu)自BD公司，兔抗鼠NK1.1抗體購(gòu)自Abcam公司(ab197979)，Trizol購(gòu)自Invitrogen公司、TransScript? First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、TransScript? Green qPCR Sup-erMix UDG試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。穿孔素、顆粒酶引物購(gòu)自上海鉑尚生物公司。Bio-Rad MyCycleTMThermal Cycler梯度PCR儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR LightCycler 480儀購(gòu)自德國(guó)Roche公司；Leica DM4000B光學(xué)顯微、LeicaQWin V3圖像分析軟件購(gòu)自德國(guó)徠卡儀器有限公司。流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2方法

1.2.1H22細(xì)胞肝臟原位移植瘤模型的建立、分組及給藥選取腹腔接種H22肝癌細(xì)胞株后腹水生長(zhǎng)良好的小鼠無(wú)菌抽取腹水，洗滌后用生理鹽水重懸細(xì)胞，顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞存活率>95%，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106ml-1，置于冰上待用。采用5%水合氯醛(0.06 ml/10 g)小鼠腹腔注射進(jìn)行麻醉，取仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)板上，碘伏消毒皮膚，劍突下沿腹中線縱行切口，逐層剪開(kāi)皮膚和腹膜，充分暴露肝左葉。用微量注射器抽取50 μl H22細(xì)胞懸液(含細(xì)胞數(shù)1×105個(gè))緩慢注入肝臟實(shí)質(zhì)，按壓至不出血后逐層縫合切口。術(shù)后24 h將小鼠隨機(jī)分為荷瘤對(duì)照組(Control)、PESV小劑量組(PEVS-L,10 mg/kg)、PESV大劑量組(PESV-H,40 mg/kg),每組8只。術(shù)后3 d開(kāi)始灌胃給藥，灌胃容量0.1 ml/10 g鼠重，每日一次，荷瘤對(duì)照組采用等體積生理鹽水灌胃，共計(jì)14 d。另取6只正常小鼠作為正常對(duì)照(Normal)。

1.2.2H22細(xì)胞肝臟原位移植瘤小鼠生存期觀察按1.2.1方法接種H22細(xì)胞后隨機(jī)分組，每組各8只，分別連續(xù)灌胃給藥14 d，于末次給藥后24 h開(kāi)始記錄各組動(dòng)物存活天數(shù)、存活數(shù)量至其自然死亡，根據(jù)公式：生存延長(zhǎng)率=(實(shí)驗(yàn)組平均生存天數(shù)-荷瘤對(duì)照組平均生存天數(shù))/荷瘤對(duì)照組平均生存天數(shù)×100%，計(jì)算生命延長(zhǎng)率。

1.2.3取材各組動(dòng)物末次給藥24 h后摘取眼球取血，頸椎脫臼法處死小鼠，取肝臟腫瘤組織，測(cè)量瘤組織最大(a)及最小(b)直徑，根據(jù)公式計(jì)算腫瘤體積(V)，V=ab2/2[6]，腫瘤抑制率(%)=[荷瘤對(duì)照組瘤質(zhì)量(g)-用藥組瘤質(zhì)量(g)]/荷瘤對(duì)照組瘤質(zhì)量(g)×100%。部分腫瘤及癌旁組織采用中性甲醛固定及-80℃凍存，部分腫瘤組織及肝組織機(jī)械研磨分離單核細(xì)胞。

1.2.4HE染色及腫瘤組織形態(tài)學(xué)觀察腫瘤組織4%中性甲醛固定24 h后，常規(guī)酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，切片，厚度4 μm；切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后，采用蘇木素-伊紅染色，水洗后，常規(guī)脫水，透明，中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察原位移植瘤組織形態(tài)變化。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)對(duì)肝臟及腫瘤浸潤(rùn)組織中NK細(xì)胞的檢測(cè)剪碎肝臟組織，200目濾網(wǎng)進(jìn)行冰上研磨，加入RPMI1640保持組織濕潤(rùn)。將研磨后的肝組織收集于離心管中，冰浴自然沉降后，吸取上層液體離心，1×PBS洗2次。采用非連續(xù)密度梯度Percoll法分離淋巴細(xì)胞[7]：用3 ml 40% Percoll溶液重懸沉淀，用吸管將其疊加于70% Percoll溶液上，離心后用滴管小心吸取2層Percoll溶液界面的白膜層至另一離心管中，離心洗滌后收集得到的細(xì)胞即為單核細(xì)胞，進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞存活率。將分離得到的單核細(xì)胞每個(gè)樣本均取1×106細(xì)胞加入流式管中，大鼠血清封閉后加入相應(yīng)的熒光抗體(FICT-CD3，PE-Cy7-NK1.1)孵育30 min，洗滌后重懸細(xì)胞并上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6免疫組織化學(xué)檢測(cè)腫瘤及癌旁組織中NK1.1陽(yáng)性細(xì)胞分布及結(jié)果判定腫瘤組織用4%中性甲醛固定24 h，石蠟包埋，切片，脫水后采用檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(0.01 mol/L,pH6.0)進(jìn)行抗原修復(fù)。正常山羊血清封閉后滴加兔抗鼠NK1.1(1∶200)一抗，4℃冰箱孵育過(guò)夜；漂洗3次后山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000)，DAB顯色劑顯色，蘇木素復(fù)染。陰性對(duì)照用PBS代替抗體。判定標(biāo)準(zhǔn)：NK1.1主要表達(dá)于C57BL/6小鼠NK細(xì)胞膜表面，參考Schmidt等[8]以及我們之前介紹的雙評(píng)分半定量法[9]對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，在400倍高倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比例進(jìn)行判定：陽(yáng)性細(xì)胞區(qū)域分4級(jí)，陽(yáng)性率<10%為1級(jí)計(jì)1分，10%～50%為2級(jí)計(jì)2分，50%～80%為3級(jí)計(jì)3分，>80%為4級(jí)計(jì)4分。染色強(qiáng)度按以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分：無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩種評(píng)分相加記為免疫組化染色評(píng)分，0分為陰性(-)，1～2分為弱陽(yáng)性(+)，3～4分為中等陽(yáng)性(++)，4分以上為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.2.7Real-time PCR法檢測(cè)癌及癌旁組織中穿孔素、顆粒酶mRNA的表達(dá)取冰凍肝癌組織采用TRizol 法提取總RNA，20 μl逆轉(zhuǎn)錄體系按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)?2℃ 30 min和85℃ 5 min。Real-time PCR選用20 μl反應(yīng)體系包括1 μl RT產(chǎn)物，0.4 μl 上游引物，0.4 μl 下游引物，10 μl 2×TransStrat Green qPCRSuperMix UDG，ddH2O至20 μl。引物序列見(jiàn)表1，反應(yīng)條件為 94℃ 10 min，94℃ 5 s,60℃ 30 s,72℃ 10 s,40個(gè)循環(huán)，熒光信號(hào)檢測(cè)。結(jié)果處理用β-actin作內(nèi)參。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，取Ct平均值，采用2-ΔΔCt相對(duì)定量的方法表示基因的相對(duì)表達(dá)量。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1PESV的抑瘤作用及對(duì)荷瘤小鼠的生存期影響經(jīng)過(guò)14 d用藥處理，PESV-H組與Control組相比小鼠腫瘤體積顯著減小(80.19±28.75 mm3vs.143.44±60.36 mm3,P<0.05)，瘤質(zhì)量降低明顯(0.18±0.0.04 g vs.0.26±0.02 g,P<0.01)；PESV-L組與Control組相比腫瘤體積無(wú)顯著差異[(96.63±28.17)mm3vs.(143.44±60.36)mm3,P>0.05]、瘤質(zhì)量減小[(0.22±0.05)g vs.(0.26±0.02)g,P<0.05]。PESV-H、PESV-L組腫瘤抑制率分別為30.77%和15.38%。各組小鼠生存時(shí)間顯示，PESV-H、PESV-L組均能延長(zhǎng)荷瘤小鼠生存時(shí)間，平均生存時(shí)間分別(38.38±1.44)d和(33.75±1.53)d，高于Control小鼠(28.63±2.09)d，生命延長(zhǎng)率分別為34.06%和17.88%，其中PESV-H組與Control組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，能顯著延長(zhǎng)小鼠的荷瘤生存時(shí)間，見(jiàn)圖1。

表1穿孔素、顆粒酶B引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

Tab.1Perforin and Granzyme B primer sequences and products length

GenePrimer(5'-3')SequencesProductslength(bp)PerforinForwardCTGCCACTCGCTCAGAATGReverseCGGAGGGTATTCACATCCAT88GranzymeBForwardTGTGAAGGGCAGGAGATGTGTGCTAReverseTCAGCTCAGCCTCTTGTAGCGTGT92β-actinForwardGGCTGTATTCCCCTCCATCGReverseCCAGTTGGTAACAATGCCATGT156

圖1　PESV對(duì)肝臟移植瘤組織生長(zhǎng)及小鼠生存期的影響Fig.1　Effects of PESV on orthotopic transplantation tumor in liver and survival time of miceNote: Ⅰ.A.Normal control group;B.Control group;C.PESV-L group;D.PESV-H group;Ⅱ.The tumor volume and weight of each group;Ⅲ.The average of survival time on each group.Compared with the control group,*.P<0.05；compared with the control group,**.P<0.01.

圖2　PESV對(duì)小鼠肝臟移植瘤組織形態(tài)學(xué)變化的影響(光學(xué)顯微鏡，×100)Fig.2　Histomorphology changes of orthotopic transpla-ntation tumor with PESV treatment in liver of mice(Optical microscope,×100)Note: A.Normal control group;B.Control group;C.PESV-L group;D.PESV-H group.

2.2PESV對(duì)原位移植瘤組織病理學(xué)變化的影響HE染色顯示，與正常對(duì)照相比荷瘤對(duì)照組小鼠腫瘤浸潤(rùn)區(qū)肝小葉結(jié)構(gòu)異常，瘤細(xì)胞異型性明顯，大小不等，形狀各異，染色質(zhì)明顯增多，細(xì)胞核深染，呈現(xiàn)分葉、多核等病理性核分裂，腫瘤細(xì)胞排列緊密，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)。PESV處理后可見(jiàn)瘤組織壞死區(qū)域有所增加，細(xì)胞異型性減輕，PESV-H組壞死區(qū)域增加顯著(圖2)，提示PESV能通過(guò)促進(jìn)腫瘤組織壞死，增強(qiáng)對(duì)腫瘤的清除作用。

2.3PESV對(duì)移植腫瘤組織中浸潤(rùn)NK的影響對(duì)各組小鼠肝臟組織及腫瘤組織提取總淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，與Normal組相比，Control組NK細(xì)胞占設(shè)門(mén)中總淋巴細(xì)胞的頻數(shù)顯著降低(3.69±0.50)% vs.(6.90±0.22)%(P<0.05)，經(jīng)PESV不同劑量干預(yù)作用后，NK1.1陽(yáng)性細(xì)胞的頻數(shù)呈增加趨勢(shì)，分別為(4.13±0.43)%和(5.91±0.49)%，其中PESV-H組與Control組組間比較差異顯著(P<0.05)，見(jiàn)圖3，提示經(jīng)PESV干預(yù)后腫瘤環(huán)境中浸潤(rùn)的NK細(xì)胞增加。

圖3　PESV對(duì)肝臟移植瘤小鼠肝臟及瘤組織浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中CD3-NK1.1+細(xì)胞比例的影響Fig.3　Effects of PESV on the proportion of NK cells in liver and tumor-infiltrating lymphocytesNote: A.Normal control group;B.Control group;C.PESV-L group;D.PESV-H group.Compared with the normal group,*.P<0.05；compared with the control group,**.P<0.05.

2.4PESV對(duì)移植瘤組織中浸潤(rùn)NK細(xì)胞分布的影響NK1.1主要表達(dá)在C57B L/6小鼠NK細(xì)胞胞膜，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色呈棕黃色顆粒。Control組中NK1.1陽(yáng)性細(xì)胞零星分布，經(jīng)PESV藥物作用后，陽(yáng)性細(xì)胞大量聚集分布于癌旁組織中，在壞死的腫瘤組織中也出現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞(圖4)。經(jīng)秩和檢驗(yàn)顯示，PESV-H組NK1.1+細(xì)胞顯著多于Control組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。

圖4　PESV對(duì)肝臟移植瘤小鼠腫瘤組織中NK1.1+細(xì)胞浸潤(rùn)分布的影響(免疫組化，×200)Fig.4　Effects of PESV on NK1.1+cell infiltration in different HCC tissues of C57BL/6 mice(IHC，×200)Note: A.Tumor-bearing control group;B.PESV-L group;C.PESV-H group.

表2不同分組肝癌組織中NK細(xì)胞的浸潤(rùn)程度

Tab.2Infiltration of NK1.1+cells in HCC tissue of different groups

Groups-++++++Control4310PESV-L2312PESV-H1)1133

Note：1)P=0.017.

2.5PESV對(duì)肝臟移植瘤小鼠腫瘤組織中穿孔素、顆粒酶B表達(dá)變化的影響與Control組相比，經(jīng)PESV不同劑量作用后，腫瘤組織中穿孔素、顆粒酶B的表達(dá)均呈增加趨勢(shì)，PESV-H組與Control組間比較差異顯著，分別是Control組的3.62倍和5.82倍，(P<0.05，P<0.01)(圖5),PESV-L組與Control組間、PESV-H組與PESV-L組組間比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

3討論

自然殺傷細(xì)胞是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)中重要成員，它識(shí)別靶細(xì)胞無(wú)MHC限制性，無(wú)需抗原預(yù)先致敏即可直接殺傷腫瘤細(xì)胞，清除體內(nèi)突變細(xì)胞，發(fā)揮免疫監(jiān)視功能[10-13]。肝臟作為機(jī)體重要的“天然免疫器官”，含有豐富的免疫細(xì)胞，其中NK細(xì)胞約占肝臟淋巴細(xì)胞的30%～50%，是其他器官或組織的5～10倍，而且肝臟NK細(xì)胞在免疫表型、形態(tài)及功能特征上都表現(xiàn)器官特異性，較外周NK細(xì)胞具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒活性和對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力[14]。盡管如此，仍有一定比例的原發(fā)性肝癌細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視形成腫瘤。Guo等[15]發(fā)現(xiàn)HCC患者外周血中NK細(xì)胞3種亞群CD3-CD56+、CD3-CD57+、CD3-CD161+含量類(lèi)似于健康志愿者，但在HCC癌組織中，CD3-CD56+、CD3-CD57+NK細(xì)胞比例顯著低于癌旁組織，這種降低可能受腫瘤微環(huán)境中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、骨髓來(lái)源的抑制性細(xì)胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSC)、細(xì)胞因子TGF-β及缺氧、低pH值等因素影響，致使NK細(xì)胞無(wú)法正常識(shí)別靶細(xì)胞，使腫瘤細(xì)胞逃避了NK細(xì)胞的殺傷[16-24]。

圖5　PESV對(duì)腫瘤組織中穿孔素、顆粒酶B mRNA的影響Fig.5　Effects of PESV on perforin and granzyme B expression detected by real-time PCR in tumor tissuesNote: *.P<0.05,compared with the control group;**.P<0.01,compared wtih the control group.

NK細(xì)胞發(fā)揮腫瘤殺傷作用主要通過(guò)其表面的活化性受體識(shí)別并黏附靶細(xì)胞，通過(guò)分泌相應(yīng)細(xì)胞因子和釋放細(xì)胞毒性穿孔素、顆粒酶等溶解、誘導(dǎo)靶細(xì)胞死亡[25，26]。穿孔素(Perforin)是一種具有溶細(xì)胞作用的糖蛋白，主要存在于細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和NK細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞毒顆粒中。穿孔素具有很高的磷酸膽堿親和性，能促進(jìn)與膜的融合并在膜上形成跨膜通道,導(dǎo)致靶細(xì)胞發(fā)生滲透性溶解，是機(jī)體抗腫瘤的主要方式之一[27]。穿孔素常與顆粒酶B(Granzyme B)協(xié)同發(fā)揮殺傷作用，誘導(dǎo)DNA斷裂并參與多條凋亡途徑，促使靶細(xì)胞凋亡[28]。

蝎毒多肽提取物是本實(shí)驗(yàn)室自東亞鉗蝎蝎毒中提取的包含50～60個(gè)氨基酸多肽混合物，前期實(shí)驗(yàn)表明PESV具有多種生物活性，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用，它可以通過(guò)抑制腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子TGF-β和VEGF的表達(dá),在抑制腫瘤組織血管生成的同時(shí)，促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)表面共刺激分子CD80/CD86的表達(dá)，提高抗原攝取與遞呈能力，解除DC的免疫逃逸狀態(tài)[29,30]。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，采用直接注射法構(gòu)建小鼠H22細(xì)胞肝臟原位移植瘤模型，與皮下移植瘤相比能較好地表現(xiàn)肝癌發(fā)生過(guò)程中免疫應(yīng)答過(guò)程。給予PESV大、小劑量藥物14 d處理后，腫瘤的體積和腫瘤質(zhì)量分別為[(80.19±28.75)mm3,(0.18±0.04)g]和[(96.63±28.17)mm3,(0.22±0.05)g]，與荷瘤對(duì)照組[(143.44±60.36)mm3,(0.26±0.02)g]相比均減小，抑瘤率分別為30.77%和15.38%,表明PESV對(duì)小鼠H22細(xì)胞原位移植瘤有一定抑制作用。通過(guò)對(duì)荷瘤小鼠生存時(shí)間的觀察發(fā)現(xiàn)PESV大、小劑量組的荷瘤小鼠平均生存時(shí)間分別為(38.38±1.44 d，33.75±1.53 d)，較荷瘤對(duì)照組小鼠(28.63±2.09 d)生存時(shí)間延長(zhǎng)，生命延長(zhǎng)率分別為33.06%及17.88%，表明PESV可延長(zhǎng)小鼠荷瘤生存時(shí)間。對(duì)肝臟腫瘤組織病理形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)荷瘤對(duì)照組形成致密瘤組織，瘤細(xì)胞具有顯著的異型性，核深染，出現(xiàn)病理性核分裂象，給藥后瘤組織出現(xiàn)不同程度的壞死，且在癌旁組織中有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。經(jīng)進(jìn)一步觀察PESV對(duì)肝癌組織中浸潤(rùn)NK細(xì)胞的影響，正常對(duì)照組與荷瘤對(duì)照組NK 細(xì)胞占淋巴細(xì)胞比例分別為(6.90±0.22)%和(3.69±0.50)%，表明在腫瘤發(fā)生過(guò)程中NK細(xì)胞受到顯著抑制，給予PESV大、小劑量干預(yù)后，NK細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中的比例分別為(5.91±0.49)%和(4.13±0.42)%，其中大劑量組顯著升高(P<0.05)，提示PESV能提高NK細(xì)胞的浸潤(rùn)程度。免疫組織化學(xué)結(jié)果證實(shí)，PESV處理后NK1.1陽(yáng)性細(xì)胞主要聚集分布在癌旁組織，浸潤(rùn)數(shù)量顯著高于荷瘤對(duì)照組。以上結(jié)果提示，給予PESV治療可以上調(diào)腫瘤浸潤(rùn)NK細(xì)胞的比例，影響其分布，在一定程度上促進(jìn)其免疫監(jiān)視功能的恢復(fù)，由于受腫瘤局部微環(huán)境等因素的影響無(wú)法恢復(fù)至正常或超過(guò)正常水平，導(dǎo)致腫瘤仍緩慢進(jìn)展。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肝癌組織中穿孔素、顆粒酶B mRNA的表達(dá)，結(jié)果表明與荷瘤對(duì)照組比較，PESV大劑量組瘤組織中穿孔素、顆粒酶B mRNA相對(duì)表達(dá)量均出現(xiàn)顯著升高，由此推斷PESV能通過(guò)上調(diào)NK細(xì)胞穿孔素、顆粒酶B的表達(dá)，提高NK細(xì)胞的活性，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的清除作用。

綜上所述，PESV可以通過(guò)調(diào)控肝癌組織中浸潤(rùn)NK細(xì)胞的比例及分布，提高NK細(xì)胞穿孔素和顆粒酶B mRNA的表達(dá)，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的清除作用，有助于恢復(fù)機(jī)體免疫監(jiān)視功能，進(jìn)一步揭示了PESV抗腫瘤作用的免疫學(xué)機(jī)制，為臨床中西醫(yī)聯(lián)合治療及NK細(xì)胞免疫過(guò)繼療法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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[收稿2015-07-11修回2015-08-04]

(編輯倪鵬)

Regulatory mechanism of PESV on tumor-infiltrating natural killer cells in liver orthotopic transplantation tumor

HANChen,WANGZhao-Xia,JIAQing,WANGZhao-Peng,ZHANGYue-Ying,ZHANGYu,WANGHeng-Xiao.

InstituteofBasicMedicine,ShandongAcademyofMedicalSciences;SchoolofMedicineandLifeSciences,UniversityofJinan-ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250062,China

[Abstract]Objective:To investigate the regulatory mechanism of PESV on tumor-infiltrating natural killer(NK) cells in a mice model with H22 orthotopic transplantation tumor.Methods: Suspensions of H22 cells were injected into the lobe of liver on C57BL/6 mice for establishing liver orthotopic transplantation tumor model ,then the mice were randomly divided into four groups:normal group，control group,PESV low dose group(PESV-L) and PESV high dose group(PESV-H).Mice were either sacrificed for mechanistic studies or survival followed 14 days of therapy.The volume and weight of the tumor were measured.The proportion of infiltrating NK cells was measured by flow cytometry and the expression of NK1.1(NK) cells was investigated by immunohistochemistry method.The expression of perforin and granzyme B were further investigated by real-time PCR.Results: In contrast to control group,the tumor inhibition rate was 15.38% and 30.77% in PESV-L group and PESV-H group respectively.The survival showed that PESV-H could significantly prolong the survival time of mice,and life extension rate was 34.06%,(P<0.05).Histological analysis revealed significant pleomorphism of the neoplastic cells and invasive extendion in control group,while there were more necrosis and less degree of atypia in PESV-L and PESV-H.The level of tumor-infiltrating NK cell was significantly higher in PESV-H than in tumor-bearing control group [(5.91±0.49)% vs.(3.69±0.50)%,P<0.05],and NK cells were infiltrating in peritumoral lesions.The mRNA of perforin and granzyme B in PESV-H were respectively 3.62 and 5.82 times than that of control group(P< 0.05).Conclusion: These findings suggest that the treatment of PESV might increase the infiltration of natural killer cells in the orthotopic transplantation tumor and contribute to NK cells migration to the tumor,which induct and maintain the activities of natural killer cells against tumor cells by expressing perforin and granzyme B in vivo.

[Key words]Scorpion venom;Hepatocellular carcinoma;Natural killer cells;Perforin;Granzyme B

中圖分類(lèi)號(hào)R73-36

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)03-0390-07

作者簡(jiǎn)介：韓琛(1981年-)，女，碩士，助教，主要從事腫瘤免疫學(xué)方面研究，E-mail ：441626282@qq.com。通訊作者及指導(dǎo)教師：王恒孝(1964年-)，男，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤免疫學(xué)方面的研究， E-mail: wanghengxiao@aliyun.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.021

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(81303077)和山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013WS0369)。