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        星毛冠蓋藤中總黃酮超聲乙醇浸提工藝的優(yōu)化

        2016-04-14 09:24:52謝金攀謝裕安毛賽蘭廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院530021南寧市河堤路71號(hào)梁瓊平金秀瑤族自治縣瑤醫(yī)醫(yī)院545708龐趙生金秀瑤族自治縣瑤醫(yī)藥研究所545708
        廣西中醫(yī)藥 2016年1期
        關(guān)鍵詞:超聲提取總黃酮正交試驗(yàn)

        謝金攀 謝裕安 楊 帆 毛賽蘭 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 530021 南寧市河堤路71號(hào)梁瓊平 金秀瑤族自治縣瑤醫(yī)醫(yī)院 545708龐趙生 金秀瑤族自治縣瑤醫(yī)藥研究所 545708

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        星毛冠蓋藤中總黃酮超聲乙醇浸提工藝的優(yōu)化

        謝金攀謝裕安楊帆毛賽蘭廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院530021南寧市河堤路71號(hào)
        梁瓊平金秀瑤族自治縣瑤醫(yī)醫(yī)院545708
        龐趙生金秀瑤族自治縣瑤醫(yī)藥研究所545708

        摘要目的:優(yōu)選星毛冠蓋藤中總黃酮的超聲乙醇浸提工藝。方法:以料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲處理時(shí)間、浸泡時(shí)間為考察因素,以總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),以正交試驗(yàn)優(yōu)選星毛冠蓋藤中總黃酮的提取工藝。結(jié)果:優(yōu)選出的最佳提取工藝為:在40℃水浴,超聲功率100 W的條件下,加入20倍量65%乙醇,室溫下浸泡星毛冠蓋藤3 h,超聲提取50 min。結(jié)論:所選工藝合理、可行,可用于星毛冠蓋藤中總黃酮的提取。

        關(guān)鍵詞星毛冠蓋藤;總黃酮;超聲提??;正交試驗(yàn)

        星毛冠蓋藤(Pileostegia tomentella Hand.-Mazz.)為虎耳草科冠蓋藤屬植物,分布于湖南、廣東、廣西等省,具有祛風(fēng)除濕、散瘀止痛、消腫解毒功能,主治腰腿酸痛、風(fēng)濕麻木、跌打損傷、骨折、外傷出血、癰腫瘡毒[1]。其同屬植物冠蓋藤(Pileostegia viburnoides Hook.f.et Thoms.)具有抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛等多種藥理活性[2-3]。目前有關(guān)星毛冠蓋藤的藥理研究尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道,實(shí)驗(yàn)證實(shí),星毛冠蓋藤中含有黃酮類化合物[4],而黃酮類化合物具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、防治血管硬化等功能[5]。超聲提取因其能縮短提取時(shí)間、效率高、溶劑用量少、低溫不破壞有效成分等優(yōu)點(diǎn),廣泛用于天然物質(zhì)的提取。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選星毛冠蓋藤中總黃酮的超聲乙醇浸提工藝,為后續(xù)的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)?,F(xiàn)報(bào)道如下。

        1 實(shí)驗(yàn)材料

        1.1儀器AL204電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司];TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);KQ-100VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司,最大功率:100 W,頻率:28/45 kHz)。

        1.2藥材星毛冠蓋藤莖和枝,2014年7月采于廣西金秀瑤族自治縣,經(jīng)廣西壯族自治區(qū)藥用植物研究所鑒定為星毛冠蓋藤,烘干,粉碎,過(guò)40目篩,備用。

        1.3試劑蘆丁對(duì)照品(上海彩佑實(shí)業(yè)有限公司,批號(hào)為KB140211,純度≥98%);無(wú)水乙醇(分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司);氯化鋁(分析純,臺(tái)山市粵僑試劑塑料有限公司)。

        2 方法與結(jié)果

        2.1星毛冠蓋藤中總黃酮的含量測(cè)定

        2.1.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取蘆丁對(duì)照品6.0 mg,置25 ml容量瓶中,加適量60%乙醇溶解并定容,搖勻,得0.24 mg/ml的對(duì)照品溶液,備用。

        2.1.2供試品溶液的制備精密稱取星毛冠蓋藤粉末10.0 g,置250 ml具塞玻璃錐形瓶中,超聲提取前無(wú)預(yù)浸泡處理,加入60%乙醇200 ml,在40℃水浴(用儀器的水浴加熱功能和流動(dòng)水控制溫度),超聲功率100 W的條件下,28/45 kHz(每5秒轉(zhuǎn)換頻率1次)超聲提取40 min。用相應(yīng)濃度乙醇補(bǔ)足重量,搖勻,抽濾,取續(xù)濾液,放冷至室溫,作為供試品溶液。

        2.1.3反應(yīng)試劑的添加精密吸取一定量待測(cè)溶液,加入25 ml容量瓶中,再精密加入0.1 mol/L AlCl3溶液1.0 ml,反應(yīng)40 min后,加60%乙醇定容至刻度。供試品溶液與AlCl3溶液反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生少量的白色絮狀沉淀,定容前過(guò)濾。

        2.1.4最佳吸收波長(zhǎng)的選擇以試劑為空白,取適量對(duì)照品溶液和供試品溶液,按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作后在190~1 100 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描,結(jié)果蘆丁在可見(jiàn)光區(qū)域有唯一波峰出現(xiàn)于412 nm處,樣品在可見(jiàn)光區(qū)域無(wú)吸收波峰出現(xiàn),在紫外光區(qū)域蘆丁與樣品于270 nm有一致的波峰,故選擇270 nm為最佳吸收波長(zhǎng)。加三氯化鋁后光譜掃描圖見(jiàn)圖1。

        2.1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定分別精密吸取對(duì)照品溶液0 ml、1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml、5.0 ml,置25 ml容量瓶中,按“2.1.3”項(xiàng)下方法精密加入反應(yīng)試劑,顯色40 min,加60%乙醇至刻度,搖勻。以第1份為空白,在270 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)。以蘆丁對(duì)照品溶液的濃度(C)為橫坐標(biāo),A為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得回歸方程為A= 35.732C-0.0002(R2=0.9999),蘆丁對(duì)照品溶液的濃度在0~0.048 mg/ml范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

        2.1.6樣品含量測(cè)定精密量取供試品溶液2 ml,按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作,以不加供試品溶液為空白,在270 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,根據(jù)回歸方程計(jì)算各樣品中總黃酮含量。

        2.2方法學(xué)考察

        2.2.1精密度試驗(yàn)精密量取供試品溶液2 ml,按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作,測(cè)定吸光度,連續(xù)測(cè)定6次。結(jié)果RSD=0.18%(n=6),表明儀器精密度良好。

        2.2.2穩(wěn)定性試驗(yàn)精密量取供試品溶液2 ml,按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作,分別在0 h、0.5 h、1.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h、4.0 h測(cè)定吸光度。結(jié)果RSD=1.02%(n=7),表明供試品溶液在4 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        2.2.3重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取星毛冠蓋藤粉末10.0 g,共6份,按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再分別精密量取供試品溶液2 ml,按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作,測(cè)定吸光度。結(jié)果RSD=0.53%(n=6),表明本方法重復(fù)性良好。

        2.2.4加樣回收率試驗(yàn)精密稱取0.5 g已知總黃酮含量(2.29 mg/g)的星毛冠蓋藤粉末,共18份,分別倒入50 ml具塞尖底玻璃離心瓶中,其中9份分為3組,分別精密加入7.63 ml、9.54 ml、11.45 ml的蘆丁對(duì)照品溶液[6],另外9份作為本底管[7],超聲提取前未浸泡,各加60%乙醇至20倍量、超聲提取40 min,按“2.1.5”項(xiàng)下方法操作,測(cè)定總黃酮的含量。計(jì)算得平均加樣回收率為98.85%,RSD=1.20%(n=9)。

        2.3單因素試驗(yàn)

        2.3.1超聲功率單因素試驗(yàn)精密稱取星毛冠蓋藤粉末10.0 g,共5份,各加入15倍量55%乙醇,超聲提取前未浸泡,分別在60 W、70 W、80 W、90 W、100 W超聲功率下超聲提取40 min,按“2.1.5”項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮含量。結(jié)果如圖2所示,隨超聲功率的提高(100 W內(nèi))總黃酮提取率呈線性上升,故選擇超聲功率為100 W。

        2.3.2料液比單因素試驗(yàn)精密稱取星毛冠蓋藤粉末10.0 g,共5份,分別加入5、10、15、20、25倍量55%乙醇,超聲提取前未浸泡,超聲提取40 min,按“2.1.5”項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮含量。結(jié)果如圖3所示,用20倍量的乙醇提取得到的總黃酮含量最高。

        2.3.3乙醇體積分?jǐn)?shù)單因素試驗(yàn)精密稱取星毛冠蓋藤粉末10.0 g,共5份,分別加入20倍量的55%、65%、75%、85%、95%的乙醇,超聲提取前未浸泡,超聲提取40 min,按“2.1.5”項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮含量。結(jié)果如圖4所示,在65%乙醇中提取得到的總黃酮含量最高。

        圖1 光譜掃描圖

        圖2 超聲功率對(duì)總黃酮含量的影響

        圖3 料液比對(duì)總黃酮含量的影響

        圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮含量的影響

        圖5 超聲提取時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響

        2.3.4超聲提取時(shí)間單因素試驗(yàn)精密稱取星毛冠蓋藤粉末10.0 g,共5份,各加入20倍量的65%乙醇超聲提取,超聲提取前未浸泡,超聲處理時(shí)間分別為30 min、40 min、50 min、60 min、70 min,按“2.1.5”項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮含量。結(jié)果如圖5所示,當(dāng)提取50 min時(shí),總黃酮的溶出已達(dá)到極限。

        2.3.5浸泡時(shí)間單因素試驗(yàn)精密稱取星毛冠蓋藤粉末10.0 g,共5份,分別加入20倍量的65%乙醇室溫下浸泡1 h、2 h、3 h、4 h、5 h后,超聲提取50 min,按“2.1.5”項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮含量。結(jié)果如圖6所示,浸泡2 h后總黃酮含量已趨于平衡。

        2.4正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,在40℃水浴和超聲功率100 W的條件下,選取浸泡時(shí)間(A)、料液比(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)、超聲提取時(shí)間(D)為考察因素,以總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),選用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn),因素水平見(jiàn)表1。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。取離差平方和(SS)最小的因素A為誤差列[8],方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

        由表2、表3的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果可知,在考察范圍內(nèi),各因素影響提取工藝的主次順序?yàn)锽>C>D>A,即料液比>乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲提取時(shí)間>浸泡時(shí)間,因素B、C 和D對(duì)提取工藝的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。最佳提取工藝條件為A2B2C2D2,即用20倍量的65%乙醇室溫下浸泡3 h后超聲提取50 min。

        2.5驗(yàn)證試驗(yàn)精密稱取星毛冠蓋藤粉末10.0 g,共3份,按上述優(yōu)選的最佳提取工藝進(jìn)行提取,其中3份測(cè)得總黃酮含量分別為5.921 mg/g、5.918 mg/g、5.919 mg/g,平均總黃酮含量為5.920 mg/g,高于表2中的最高值,表明所選工藝穩(wěn)定、可行,可用于星毛冠蓋藤中總黃酮的提取。

        3 討 論

        因?yàn)楦邷貢?huì)破壞成分,所以本研究未采用回流提取法和熱水提取法。隨著提取時(shí)間的增加,由于超聲的熱效應(yīng),水浴溫度會(huì)有所升高,故本實(shí)驗(yàn)同時(shí)采用流動(dòng)水控制水浴溫度。雖然黃酮類化合物因分子中具有酚羥基而顯酸性,但堿性條件下的處理和后期的酸化對(duì)成分研究均產(chǎn)生一定程度的干擾,因此不將溶劑的pH值作為考察因素。綜上考慮,本實(shí)驗(yàn)在40℃水浴,以超聲功率、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲提取時(shí)間、浸泡時(shí)間為考察因素,通過(guò)單因素和正交試驗(yàn),優(yōu)選最佳提取工藝條件。

        (4) 盾尾間隙的大小由盾構(gòu)機(jī)機(jī)型和刀具布置決定,過(guò)小的盾尾間隙對(duì)于減小地表沉降有一定作用,但結(jié)合工程實(shí)際,盾尾間隙過(guò)小亦可能對(duì)盾構(gòu)機(jī)掘進(jìn)姿態(tài)調(diào)整帶來(lái)不便。因此需通過(guò)全面考慮和權(quán)衡再來(lái)進(jìn)行盾構(gòu)機(jī)機(jī)型的選取[14]。

        實(shí)驗(yàn)表明在其它條件不變時(shí),60~100 W范圍內(nèi)的超聲功率對(duì)星毛冠蓋藤中總黃酮的提取率有所影響(圖2),但100 W以上的超聲功率是否更佳則有待進(jìn)一步探究。同等條件下,隨著料液比的增加,溶劑過(guò)多,可能是由于分散了作用于藥材的超聲能量,導(dǎo)致總黃酮的提取量更低(圖3)。不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇可以提取不同極性的黃酮,高濃度的乙醇(90%~95%)適用于游離黃酮的提取,60%濃度左右的乙醇適用于黃酮苷類的提取[9],從圖4和表2結(jié)果可以推測(cè)星毛冠蓋藤中總黃酮以黃酮苷類為主,而含游離黃酮較少。正交設(shè)計(jì)沒(méi)有空白列時(shí),雖然重復(fù)試驗(yàn)可提高試驗(yàn)精確度和可靠性,但明顯增加了試驗(yàn)次數(shù)。根據(jù)專業(yè)書(shū)籍[8],選擇離差平方和中最小者作近似估計(jì)也是允許的。盡管在表3中取離差平方和(SS)最小的因素A(浸泡時(shí)間)為誤差項(xiàng),但從圖6能夠看出浸泡作為超聲提取的預(yù)處理也很有必要。提取時(shí)間和浸泡時(shí)間越長(zhǎng),雜質(zhì)也產(chǎn)生越多,超出一定范圍,對(duì)總黃酮的提取可產(chǎn)生不利影響(圖5、圖6)。兼顧節(jié)約能源和節(jié)省時(shí)間,本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選最佳提取工藝條件為A2B2C2D2,即用20倍量的65%乙醇室溫下浸泡3 h后超聲提取50 min。根據(jù)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果,表明提取工藝合理、可行,可用于星毛冠蓋藤中總黃酮的提取。

        圖6 浸泡時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響

        表1 因素水平表

        表2 正交試驗(yàn)方案安排與結(jié)果

        表3 方差分析結(jié)果

        參考文獻(xiàn)

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        (2015-12-29收稿/編輯陳明偉)

        基金項(xiàng)目:廣西衛(wèi)生廳適宜技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)項(xiàng)目(編號(hào):S201417-05)

        中圖分類號(hào):R284.2

        文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

        文章編號(hào):1003-0719(2016)01-0069-05

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