褚國(guó)芳　趙鳳芹　石少敏

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院呼吸內(nèi)科，吉林　長(zhǎng)春　130033)

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臨床高危因素及凝血酶原基因G20210A突變和FVL突變對(duì)肺栓塞的診斷預(yù)測(cè)價(jià)值

褚國(guó)芳趙鳳芹石少敏

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院呼吸內(nèi)科，吉林長(zhǎng)春130033)

〔摘要〕目的研究肺栓塞(PE)的臨床高危因素，探討凝血酶原基因G20210A突變和凝血因子Ⅴ Leiden(FVL)突變對(duì)中國(guó)東北地區(qū)人群肺血栓栓塞(PTE)的預(yù)測(cè)價(jià)值。方法回顧性分析126例確診PE患者的臨床高危因素資料。通過(guò)排除標(biāo)準(zhǔn)選取96例PTE患者作為實(shí)驗(yàn)組，選取同期來(lái)自相同地區(qū)，性別和年齡相匹配的健康人96例作為對(duì)照組，采取聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶片段多肽性分析(RFLP)，檢測(cè)兩組凝血因子V基因和凝血酶原G20210A基因的突變。結(jié)果126例患者均存在臨床高危因素，其中深靜脈血栓形成(DVT)90例(71.4%)，慢性心肺疾病者41例(32.5%)，手術(shù)史30例(23.8%)，腫瘤病史25例(19.8%)，外傷史者21例(16.7%)，長(zhǎng)期臥床10例(7.9%)，肥胖9例(7.1%)，DVT溶栓治療過(guò)程中發(fā)病8例(6.3%)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡1例(0.8%)，燒傷1例(0.8%)。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組凝血酶原基因G20210A和FVL突變頻率均為0%，兩組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論P(yáng)E常見(jiàn)臨床高危因素包括DVT、慢性心肺疾病、手術(shù)、腫瘤、外傷及肥胖等因素。凝血酶原基因G20210A突變、FVL突變對(duì)我國(guó)東北地區(qū)人群PTE診斷沒(méi)有預(yù)測(cè)價(jià)值。

〔關(guān)鍵詞〕肺栓塞；血栓；遺傳；突變

肺栓塞(PE)是一種常見(jiàn)的呼吸科急癥，西方國(guó)家發(fā)現(xiàn)凝血酶原基因G20210A突變及凝血因子V基因Leiden(FVL)突變與靜脈血栓栓塞癥〔VTE，包括肺血栓栓塞(PTE)和深靜脈血栓形成(DVT)〕密切相關(guān)。大多數(shù)相關(guān)研究認(rèn)為上述兩種基因突變存在種族和地區(qū)差異〔1〕，且同時(shí)增加了VTE的發(fā)生率及復(fù)發(fā)率〔2〕；僅有少數(shù)研究表明兩項(xiàng)基因突變與VTE復(fù)發(fā)無(wú)明確相關(guān)性〔3〕。國(guó)內(nèi)的大多研究認(rèn)為中國(guó)人群不存在這兩種基因突變，在東北地區(qū)尚缺乏相關(guān)性研究。本文擬分析其與中國(guó)東北地區(qū)人群PTE的相關(guān)性。

1對(duì)象與方法

1.1對(duì)象選擇2013年10月至2015年10月在吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院臨床確診PE住院患者126例，其中男68例，女58例，年齡21~83歲，平均(53.78±12.38)歲。經(jīng)螺旋CT肺動(dòng)脈造影(CTPA) 和(或)核素肺灌注顯像發(fā)現(xiàn)充盈缺損，并結(jié)合臨床癥狀確診，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病分會(huì)“肺血栓栓塞癥診斷與治療指南(草案)”〔4〕。實(shí)驗(yàn)組：患者126例臨床確診PE患者，其中符合條件的PTE96例，男52例，女44例，年齡21~80歲，平均(54.82±11.27)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①分娩中及分娩后出現(xiàn)PE；②長(zhǎng)骨骨折、嚴(yán)重脂肪組織挫傷或脂肪擠壓傷患者合并PE；③腫瘤患者合并PE。

對(duì)照組：選擇同期吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院健康志愿者或體檢正常者96例，男52例，女44例，年齡20~82歲，平均(53.96±12.36)歲。均與PTE患者來(lái)自相同地區(qū)，年齡、性別相似，無(wú)PTE病史及家族史，無(wú)風(fēng)濕、內(nèi)分泌、腎、肺等系統(tǒng)疾病史，無(wú)腫瘤病史，無(wú)近期妊娠、分娩及外傷者。所有研究對(duì)象均在東北地區(qū)居住5年及以上。兩組性別構(gòu)成及年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)所有研究對(duì)象遵循醫(yī)學(xué)倫理學(xué)一般原則，均知情同意。

1.2方法

1.2.1觀察指標(biāo)回顧性分析患者的年齡、性別、體重及既往有無(wú)DVT、心肺疾病、腫瘤、外傷、手術(shù)、制動(dòng)及長(zhǎng)期臥床等。

1.2.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.2.1PCR 及Hind Ⅲ限制性酶切實(shí)驗(yàn)抽取研究對(duì)象靜脈血2 ml，用試劑盒提取其DNA后保存。分別用以下引物：Prothrombin 基因：FⅡ20210-1：5′-GCA CAG ACG GCT GTT CTC T T-3′，F(xiàn)Ⅱ20210-2：5′-ATA GCA CTG GGA GCA TTG AAG C-3′；Factor V基因：FV-1：5′-TCA GGC AGG AAC AACACC AT-3′，F(xiàn)V-2：5′-GGT TAC TTC AAG GAC AAA ATA CCT GTA AAG CT-3′〔5〕，在PCR擴(kuò)增儀中經(jīng)35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增凝血酶原基因和凝血因子Ⅴ基因相關(guān)片段，將擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，再通過(guò)凝膠成像儀系統(tǒng)分析。然后通過(guò)Hind Ⅲ對(duì)擴(kuò)增成功的基因PCR產(chǎn)物，進(jìn)行酶切實(shí)驗(yàn)，對(duì)產(chǎn)物10 μl進(jìn)行電泳，用凝膠成像儀分析。

1.2.2.2酶切結(jié)果判斷酶切可得到3種基因型：(1)Prothrombin 基因：Homozygotes(純合型A/A)384 bp，99 bp，23 bp；Heterzygotes(雜合型G/A)：407 bp，384 bp，99 bp，23 bp；Wild type(野生型G/G)：407 bp，99 bp。(2)Factor V基因：Homozygotes(純合型Q/Q)：209 bp，32 bp；Heterzygotes(雜合型R/Q)：241 bp，209 bp，32 bp；Wild type(野生型R/R)：241 bp。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS21.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

126例患者均存在臨床高危因素，其中合并DVT 90例(71.4%)，慢性心肺疾病41例(32.5%)，手術(shù)史30例〔23.8%，其中關(guān)節(jié)置換術(shù)3例(2.4% )〕，腫瘤病史者25例〔19.8%，其中肺癌4例(3.2%)〕，外傷史者21例〔16.7%，其中車禍?zhǔn)?例(2.38%)〕，長(zhǎng)期臥床10例(7.9%)，肥胖9例(7.1%)。DVT溶栓治療過(guò)程中發(fā)病8例(6.3%)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡1例(0.8%)，燒傷1例(0.8%)。存在1個(gè)危險(xiǎn)因素的47例(37.3%)，2個(gè)危險(xiǎn)因素45例(35.7%)，3個(gè)高危因素27例(21.4%)，4個(gè)或4個(gè)以上高危因素7例(5.6%)。

PCR擴(kuò)增結(jié)果：Prothrombin 基因：506 bp(圖1)，F(xiàn)actor V 基因：241 bp(圖2)。所有Prothrombin 基因PCR擴(kuò)增的DNA片段，經(jīng)酶切后均出現(xiàn)大小為407 bp和99 bp的DNA條帶(圖3)。所有Factor V 基因PCR擴(kuò)增的DNA片段，經(jīng)酶切后均僅出現(xiàn)1條大小為241 bp的DNA條帶(圖4)。表明Prothrombin 基因擴(kuò)增序列只有1個(gè)酶切位點(diǎn)，兩組基因都不存在因基因突變導(dǎo)致的Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)，所有樣本均是野生型基因。

1~12 PTE患者；13~21對(duì)照組圖1　Prothrombin G20210基因 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

1~12 PTE患者；13~23對(duì)照組圖2　Factor V基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

1~12 PTE患者；13~24對(duì)照組圖3　Prothrombin G20210基因 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 HindⅢ酶切電泳圖

1~12 PTE患者；13~22對(duì)照組圖4　Factor V基因 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 Hind Ⅲ酶切電泳圖

3討論

1856年Virchow提出菲爾紹血栓三要素：血流停滯、血液高凝狀態(tài)及血管內(nèi)皮損傷，各項(xiàng)高危因素都是以上三要素部分或全部參與的結(jié)果。乏氧、外傷及手術(shù)均可導(dǎo)致血管內(nèi)皮系統(tǒng)損失，而乏氧、腫瘤、心肺疾病及肥胖會(huì)引起血液高凝，臥床、術(shù)后制動(dòng)顯而會(huì)導(dǎo)致血液瘀滯。心肺疾病及其他原因引起的長(zhǎng)期乏氧可導(dǎo)致紅細(xì)胞增多，血液高凝狀態(tài)，同時(shí)釋放NO和血栓素?fù)p傷血管內(nèi)皮。惡性腫瘤細(xì)胞及其產(chǎn)物與其宿主之間的相互作用可導(dǎo)致血液高凝，腫瘤細(xì)胞表達(dá)及釋放組織因子(TF)、絲氨酸蛋白酶hepsin和癌促凝物質(zhì)(CP)三種主要促凝物質(zhì)〔6〕。腫瘤壓迫、浸潤(rùn)血管，腫瘤的手術(shù)及放化療均會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮系統(tǒng)損傷、血流緩慢。大部分研究認(rèn)為PE的臨床高危因素為DVT、心肺疾病、創(chuàng)傷手術(shù)、惡性腫瘤、口服避孕藥、妊娠、腎病綜合征及結(jié)締組織疾病等。本文PE的臨床高危因素為DVT、慢性心肺疾病、手術(shù)、腫瘤、外傷及肥胖等因素，與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)論基本相符，但無(wú)口服避孕藥、妊娠及腎病綜合征者等，可能與本研究病例數(shù)較少有關(guān)，可能與我國(guó)口服避孕藥人群明顯低于歐美國(guó)家亦相關(guān)。另外，許多惡性腫瘤病人在病程中出現(xiàn)血栓性疾病，也有部分病人先出現(xiàn)血栓栓塞，后發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤，兩者間的因果關(guān)系尚有待于進(jìn)一步研究。Poort等〔7〕于1996年發(fā)現(xiàn)凝血酶原基因mRNA前體3′端未翻譯區(qū)第20210位核苷酸發(fā)生G-A突變，稱為凝血酶原G20210A突變，突變后使基因合成增多，或轉(zhuǎn)錄的mRNA破壞減少，進(jìn)而使凝血酶原水平升高，從而導(dǎo)致血液高凝。雜合的G20210A等位基因在靜脈血栓者中檢出率為7%~18%〔8〕，而攜帶該基因的雜合子突變可使VTE發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)增加2~4倍〔9〕。在非西班牙人和墨西哥裔美國(guó)人中該基因突變的檢出率為1.1%，而在美國(guó)黑人中的檢出率為0.3%〔10〕，但在有關(guān)中國(guó)人的大多數(shù)研究中檢出率為0%〔11，12〕。

Dahlback等〔13〕于1993年發(fā)現(xiàn)活化蛋白C抵抗(APCR)是導(dǎo)致血液高凝的重要遺傳因素。其后，Bertina等〔14〕發(fā)現(xiàn)FVL突變是活化蛋白C抵抗的原因，該突變是凝血因子Ⅴ基因10號(hào)外顯子1 691位核苷酸發(fā)生G-A突變，改變凝血因子Ⅴa分子上的活化蛋白C(APC)裂解位點(diǎn)，APC無(wú)法滅活凝血因子Ⅴa〔15〕，造成凝血因子Ⅴa對(duì)APC抗凝血活性產(chǎn)生抵抗，即APCR。FVL突變與種族和地區(qū)分布有關(guān)，其檢出率為2%~13%〔8〕，在歐美白種人中，F(xiàn)VL突變?cè)陟o脈血栓者中的檢出率為12%~30%，攜帶該突變可使VTE的風(fēng)險(xiǎn)升高7倍〔16〕。該基因突變?cè)谖靼嘌廊酥胁怀Ｒ?jiàn)，在非洲、亞洲人中極為少見(jiàn)。我國(guó)北京、上海、山東、新疆等地亦有關(guān)于該基因突變的研究，大多數(shù)表明其檢出率均為0%。

研究發(fā)現(xiàn)凝血酶原基因G20210A突變和FVL突變可存在于正常白種人中，西方國(guó)家提出其突變，正如腫瘤的癌基因與抑癌基因一樣，其致病也有激發(fā)及抑制因素，可能的激發(fā)因素有慢性肝病，但在臨床高危因素中我們未統(tǒng)計(jì)慢性肝病者，以后研究可納入。我們開(kāi)展的PTE遺傳因素的相關(guān)研究，一直未檢出這兩項(xiàng)基因突變。本次研究適當(dāng)增加病例數(shù)，仍未發(fā)現(xiàn)凝血酶原G20210A突變和FVL突變，這兩項(xiàng)基因突變可能對(duì)我國(guó)東北地區(qū)人群PTE的診斷沒(méi)有預(yù)測(cè)價(jià)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同國(guó)內(nèi)大多數(shù)研究結(jié)果一致。然而由于本組研究樣本例數(shù)較少，且相關(guān)研究在國(guó)內(nèi)開(kāi)展的范圍較小，以后還需擴(kuò)大地區(qū)、擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

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〔2015-11-10修回〕

(編輯滕欣航)

〔中圖分類號(hào)〕R563.5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)05-1136-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.053

通訊作者：趙鳳芹(1964-)，女，主任醫(yī)師，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事肺栓塞、肺癌及呼吸系統(tǒng)感染性疾病的研究。

基金項(xiàng)目：吉林省科技廳基礎(chǔ)處資助項(xiàng)目(201115092)

·呼吸、消化系統(tǒng)疾病·

第一作者：褚國(guó)芳(1988-)，女，在讀碩士，主要從事呼吸病學(xué)研究。