劉得水　興桂華　盧長方　高志影　張曉杰

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江　齊齊哈爾　161006)

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β-細(xì)辛醚對(duì)抑郁模型大鼠海馬和血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶變化的干預(yù)作用

劉得水興桂華盧長方高志影張曉杰

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006)

〔摘要〕目的探討抑郁模型大鼠海馬和血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)變化及石菖蒲有效成分β-細(xì)辛醚的干預(yù)作用。方法采用慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激(CUMS)結(jié)合孤籠飼養(yǎng)建立穩(wěn)定、可行的大鼠抑郁癥模型；運(yùn)用曠場實(shí)驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)檢測；采用免疫組織化學(xué)檢測對(duì)大鼠海馬NSE表達(dá)量，應(yīng)用ELISA方法測定血清NSE水平變化。結(jié)果與空白對(duì)照組大鼠比較，給予28 d的CUMS大鼠的自主活動(dòng)得分減少，海馬區(qū)神經(jīng)元NSE表達(dá)量減少(P<0.05)，但血清中NSE水平無顯著差異；給予陽性藥氟西汀(10 mg·kg-1·d-1)及β-細(xì)辛醚(25 mg·kg-1·d-1)均能顯著提高CUMS大鼠的自主活動(dòng)得分，海馬CA3區(qū)神經(jīng)元NSE表達(dá)量增多(P<0.05)，但對(duì)血清中NSE水平無影響。結(jié)論β-細(xì)辛醚具有明顯的抗抑郁作用，可能是通過提高神經(jīng)元活性，減少神經(jīng)元損傷，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)CUMS大鼠神經(jīng)的保護(hù)作用。

〔關(guān)鍵詞〕抑郁癥；β-細(xì)辛醚；神經(jīng)元特異性烯醇化酶

抑郁癥(MDD)是一種復(fù)雜的異質(zhì)性疾病。石菖蒲屬于醒腦開竅類中藥，有效成分主要為揮發(fā)油，β-細(xì)辛醚是揮發(fā)油的主要成分，被認(rèn)為是其藥理作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用〔1〕。本實(shí)驗(yàn)建立大鼠MDD模型，觀察β-細(xì)辛醚對(duì)給予慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激(CUMS)的大鼠腦海馬區(qū)神元特異性烯醇化酶(NSE)和血清NSE水平的影響，探討β-細(xì)辛醚對(duì)CUMS大鼠神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制。

1材料與儀器

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠80只，購買于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物醫(yī)學(xué)部，許可證編號(hào)：SCXK(黑)2013-0001。大鼠在動(dòng)物房中適應(yīng)環(huán)境7 d后開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2試劑β-細(xì)辛醚(天津一方科技有限公司)；鹽酸氟西汀(上海中西制藥有限公司)。尼氏染色液(索萊寶科技有限公司)，anti-NSE antibody(EPITOMICS 公司)；免疫組化SP試劑盒(邁新生物技術(shù)有限公司)；NSE ELISA試劑盒(博海生物科技有限公司)。

1.3儀器CX41RBSF光學(xué)顯微鏡，PM-20型全自動(dòng)顯微攝影儀，Tecan Safire2酶標(biāo)儀。

1.4方法

1.4.1動(dòng)物分組及給藥大鼠隨機(jī)分成4組：對(duì)照組：常規(guī)飼養(yǎng)；模型組：CUMS+生理鹽水；氟西汀組：CUMS+鹽酸氟西汀(10 mg·kg-1·d-1)；β-細(xì)辛醚組：CUMS+β-細(xì)辛醚組(25 mg·kg-1·d-1)，每組20只。對(duì)照組不給予藥物處理，其余各組在建模起分別口服或灌胃給予生理鹽水或相應(yīng)藥物，1次/d，共28 d。

1.4.2建立CUMS抑郁模型對(duì)照組每5只大鼠一籠飼養(yǎng)，不給予任何刺激，自由飲水?dāng)z食。其余各組每籠飼養(yǎng)1只大鼠，每天隨機(jī)選用2種應(yīng)激方式，持續(xù)28 d。應(yīng)激方法參照文獻(xiàn)〔2〕并稍行改進(jìn)，給予CUMS的大鼠單籠孤養(yǎng)，每周互換一次鼠籠。

1.4.3行為學(xué)檢測曠場實(shí)驗(yàn)〔3〕，造模第29天，在安靜而且弱光環(huán)境下用曠場實(shí)驗(yàn)法觀察記錄大鼠5 min內(nèi)動(dòng)作行為表現(xiàn)。

1.4.4免疫組織化學(xué)法檢測海馬NSE表達(dá)石蠟切片，脫蠟，脫苯水化；高壓修復(fù)；H2O2孵育；正常非免疫動(dòng)物血清孵育；anti-NSE抗體，4℃過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌；二抗孵育，PBS洗滌；加鏈霉素抗生素蛋白-過氧化酶孵育，PBS洗滌，DAB顯色，PBS終止顯色；復(fù)染，返藍(lán)，透明，封片；顯微鏡下觀察，采集圖片。

1.4.5酶聯(lián)免疫分析法檢測血清NSE將板內(nèi)NSE孔內(nèi)加入含NSEO的標(biāo)準(zhǔn)物100 μl，取樣品稀釋液50 μl加入樣品孔，孵育，洗板，甩干；加酶標(biāo)抗體，洗板，甩干；加OPD液，顯色；終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上于492 nm波長處檢測吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成實(shí)際NSE濃度(μg/L)。

1.5統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1β-細(xì)辛醚對(duì)CUMS大鼠行為學(xué)的影響持續(xù)給予28 dCUMS刺激之后，模型組大鼠與對(duì)照組大鼠相比表現(xiàn)出水平運(yùn)動(dòng)與垂直運(yùn)動(dòng)得分明顯減少(P<0.05)；與模型組比較，β-細(xì)辛醚和氟西汀均能增加CUMS大鼠的水平運(yùn)動(dòng)與垂直運(yùn)動(dòng)得分(P<0.05)。見表1。

表1　β-細(xì)辛醚對(duì)CUMS大鼠曠場實(shí)驗(yàn)垂直運(yùn)動(dòng)和

2.2β-細(xì)辛醚對(duì)海馬NSE蛋白表達(dá)影響持續(xù)給予28 d CUMS刺激之后，采用免疫組化技術(shù)檢測各組大鼠海馬NSE蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組(24.30±3.15)比較，模型組大鼠海馬NSE蛋白表達(dá)(10.09±3.56)減少(P<0.05)。與模型組比較，β-細(xì)辛醚(18.28±4.90)及陽性藥氟西汀(19.77±4.46)均可提高NSE蛋白表達(dá)(P<0.05)。

2.3β-細(xì)辛醚對(duì)CUMS大鼠血清NSE水平的影響持續(xù)給予28 d的UMS之后，與對(duì)照組〔(3.44±0.53)ng/L〕比較，模型組大鼠血清NSE水平〔(3.69±0.61)ng/L〕無顯著性差異(P>0.05)；與模型組相比，給藥組大鼠血清NSE水平〔氟西汀組(3.42±0.64)ng/L，β-細(xì)辛醚組(3.51±0.82)ng/L〕也無顯著性差異(P>0.05)。

3討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激性生活事件是MDD發(fā)生的促發(fā)因素〔4〕，在一個(gè)新奇的環(huán)境中動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生類似焦慮的抑郁樣表現(xiàn)，動(dòng)物的這種焦慮反應(yīng)經(jīng)抗抑郁藥物治療后可以有所緩解，表現(xiàn)為水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)減少，因此，通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測可應(yīng)用于抗抑郁藥物的篩選以及藥效的初步評(píng)價(jià)。本研究表明β-細(xì)辛醚能夠顯著改善CUMS大鼠的焦慮癥狀，具有明顯的抗抑郁作用。

NSE是烯醇化酶基因超家族的一員，可催化2-磷酸甘油酸到磷酸烯醇式丙酮酸的轉(zhuǎn)化，是糖酵解過程中的關(guān)鍵酶〔5〕。烯醇化酶主要由α、β、γ三個(gè)亞基組成的二聚體，而γ亞基特異性存在于神經(jīng)元和神經(jīng)來源的細(xì)胞中，故被命名為NSE〔6〕。NSE在正常體液中含量很低，在腦組織中分布最多〔7〕，已成為神經(jīng)元損傷的特征性標(biāo)志物。夏軍等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)，抑郁模型大鼠NSE表達(dá)減弱，而經(jīng)過藥物治療后大鼠的NSE表達(dá)增強(qiáng)，Abumaria等〔9〕發(fā)現(xiàn)使用抗抑郁劑能夠提高抑郁樣癥狀大鼠海馬NSE mRNA表達(dá)。通過本研究可以推測，β-細(xì)辛醚通過提高海馬神經(jīng)元NSE表達(dá)，增加神經(jīng)元的能量供應(yīng)，從而對(duì)給予CUMS的大鼠起到神經(jīng)保護(hù)作用。

4參考文獻(xiàn)

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9Abumaria N，Rygula R，Hiemke C，etal.Effect of chronic citalopram on serotonin-related and stress-regulated genes in the dorsal raphe nucleus of the rat〔J〕.Eur Neuropsychopharmacol J Eur Coll Neuropsychopharmacol，2007;17(6-7):417-29.

〔2015-12-03修回〕

(編輯郭菁/滕欣航)

〔中圖分類號(hào)〕R749.4

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)05-1040-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.007

通訊作者：張曉杰(1965-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，博士，主要從事神經(jīng)精神疾病的病理學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(H201354)

第一作者：劉得水(1981-)，男，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事神經(jīng)精神疾病的病理學(xué)研究。