艾紅輝，鐘 偉，龍 平，吳英華，胡錦芳

(南昌大學第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，南昌 330006)

miR-155在變應性鼻炎患者血清中的高表達

艾紅輝，鐘 偉，龍 平，吳英華，胡錦芳

(南昌大學第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，南昌 330006)

目的 探討miR-155在變應性鼻炎(allergic rhinitis,AR)患者外周血清中的表達。方法 分別提取變應性鼻炎及健康人群外周血清中總RNA并進行質檢;應用實時熒光定量PCR技術檢測驗證變應性鼻炎患者外周血清中miR-155與正常對照者的表達差異。結果 AR患者外周血中細胞總數(shù)及嗜酸性粒細胞數(shù)高于正常對照組，血清中miR-155顯著高于正常對照組，是正常對照組的2.1倍。結論 miR-155在AR患者血清中為高表達。

變應性鼻炎; miRNA-155； 血清； 高表達

變應性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是耳鼻喉科的常見病和多發(fā)病,其典型臨床表現(xiàn)為反復發(fā)作的鼻癢、噴嚏及清水樣涕，是一種全身免疫紊亂在上呼吸道的表現(xiàn)。保守估計全球的AR患者超過5億[1]，我國也早在2004年就進行AR流行狀況的多中心調(diào)查[2],發(fā)病率高達20%[3]。本病的關鍵在于Th2>Thl的免疫反應，此病易治療難控制。近年來，MicroRNA在變應性鼻炎發(fā)生發(fā)展中的作用已日益受到關注。在眾多miRNA當中，microRNA-155是免疫系統(tǒng)最主要的miRNA之一，在活化的各種免疫細胞中表達普遍升高，廣泛參與固有免疫應答和適應性免疫應答。

本文通過檢測AR中血清miRNA-155的表達情況，分析求證在AR發(fā)病過程中miRNA在血清中的特異性表達，探討其可能的診斷和預后的靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年1至2013年1月南昌大學第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科接診的AR患者(AR組)22例，年齡16～40歲，其中男15例，女7例，平均年齡21.5歲。均符合2009年福建武夷山制定的《變應性鼻炎診斷和治療指南》的標準確診[4]，為持續(xù)性變應性鼻炎，癥狀為中-重度，皮膚點刺試驗中僅屋塵螨()，且不伴有鼻竇炎、哮喘及阿司匹林耐受不良等疾病，最近3個月內(nèi)未接受全身或局部糖皮質激素治療，未經(jīng)抗組胺和免疫治療。同時選擇在本科要求體檢年齡、性別相當健康人22例作為對照組，男13例，女9例，平均年齡19.08歲，皮膚點刺試驗全部陰性。所有受試者均需常規(guī)檢查取血，在征求知情同意后入組備血，并簽署知情同意書，報由南昌大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準。全部患者均采取肘靜脈取血。

1.2 標本收集與檢測方法

1.2.1 標本采集與處理

所有入組人員常規(guī)檢測血壓，查血常規(guī)，C反應蛋白，嗜酸性粒細胞；同時備血通過2次離心獲得無細胞血清，簡言之：離心得上層血清后，在取血30 min 內(nèi)以1500 r·min-1離心10 min，取上層血清于-80 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血清總RNA的提取與質檢

采用美國Qiagen公司試劑盒(miRNeasy Serum/Plasma Kit)并參照說明書分別提取變應性鼻炎組與對照組的總RNA。紫外分光光度計分別測定波長230、260和280 nm的吸光度(A)值，確定樣品總RNA的純度和濃度；甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品總RNA中28 s和18 s的比例，評估RNA純度及完整性。

1.2.3 實時熒光定量PCR

使用美國Qjagen公司試劑盒fmiScript SYBR Green PCR Kit)，根據(jù)說明書進行。驗證變應性鼻炎患者與對照者中miR-155的表達[5]。

取總RNA各1 μg進行反轉錄。RT引物序列:miR-155，5’-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3’。RT反應程序:16 ℃ 30 min,42 ℃ 42 min，85 ℃5 min。實時定量PCR反應體系:反轉錄產(chǎn)物1 μL，dNT P(2.5 mmol) 21 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，MgCl2溶液1.5 μL,T aq聚合酶1 U，SYBER greenⅠ終濃度0.25×10 μmol的PCR特異引物(miR-574-5p：5’-GGGGGTGAGTGTGTGTGTGT-3’，5’-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3’)1 μL，加水至總體積為25 μL。Realt imePCR儀進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 樣品總RNA質量鑒定

血清中提取的總RNA純度高，蛋白質和DNA污染少，總RNA中各條帶清晰，無明顯降解現(xiàn)象(封四圖1)。質量鑒定結果表明各樣品總RNA質量符合miRNA微陣列要求，可以進行后續(xù)芯片實驗。

2.2 AR組外周血氣道炎癥明顯高于正常對照組

AR組外周血中嗜酸粒細胞增多，符合變應性鼻炎特征表現(xiàn)(封四圖2，P<0.05,n=22)。

2.3 AR組血清miRNA-155顯著高于正常對照組

Real-time PCR法檢測AR組血清miRNA-155的表達，結果顯示:符合變應性鼻炎癥狀體征、皮膚過敏原點刺試驗陽性的AR患者，血清miRNA-155表達量約為正常對照組的2.1倍(封四圖3，P<0.05,n=22)。

2.4 miR-155與炎癥指標的相關分析

血清miRNA-155表達水平與臨床炎癥指標EO%呈正相關(封四圖4，r=0.346，P<0.01)。進一步進行線性逐步回歸分析，結果顯示EO%與miRNA-155水平呈獨立正相關(r=2.968.847，P=0.440，P=0.001)。

3 討論

微小核糖核酸(microRNAs,miRNA)是一類在轉錄后基因調(diào)控中發(fā)揮功能的非編碼小RNAs,在發(fā)育、生長的分化等過程中發(fā)揮重要作用。miRNA可以通過降解mRNA或抑制蛋白翻譯的方式調(diào)節(jié)特異基因表達。無論是健康人或者患者血清中都存在大量的miRNA,都有特異性表達。由于外周血的獲得越來越簡單，能在血液中檢出特異性的miRNA并將其作為變應性鼻炎的生物學標志具有更廣泛的意義。

血清miRNA在過敏性鼻炎中的功能和表達研究相對較少。Shao等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在過敏性鼻炎患者鼻黏膜中有9個miRNAs發(fā)生兩倍以上的變化，經(jīng)驗證發(fā)現(xiàn)miR-143、miR-187和miR-224表達水平降低。本研究通過比較變應性鼻炎患者與健康試驗者血清miR-155的表達情況，提示miR-155在變應性鼻炎中的高表達，可能miR-155是參與變應性鼻炎發(fā)病的miRNA,這對AR患者個性化的診斷、治療，具有良好的前景及潛在性價值。

[1] Bousquet J,Khaltaev N,Cruz A A,et al.Allergic rhinitis and its impact on asthma(ARIA)2008 update(in collaboration with the world health organization，GA2LEN and AllerG-en)[J].Allergy,2008,63:8-160.

[2] 韓德民，張羅，黃丹，等.我國11個城市變應性鼻炎自報患病率調(diào)查[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科學雜志,2007,42(5):378-384.

[3] Zhao J,Bai J,Shen K,et al.Self-reported prevalence of childhood allergic diseases in three cities of China:a multicenter study[J].BMC Public Health，2010,10:551.

[4] 中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志編委會.變應性鼻炎診斷和治療指南(2009 年，武夷山)[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2009，44(12):977-978.

[5] 揭偉，王曉燕，羅泊濤，等.應用微陣列芯片分析不同分化鼻咽癌細胞株miRNA 的表達[J].華中科技大學學報:醫(yī)學版,2010,6(39):336-341.

[6] Shao Q Y，Ru X Z，Guo J L，et al.Microarray analysis of differentially expressed microRNAs in allergic rhinitis[J].Am J Rhinol Allergy，2011，25(6):e242-e246.

(責任編輯：劉大仁)

High Expression of miRNA-155 in Serum of Patients with Allergic Rhinitis

AI Hong-hui,ZHONG Wei,LONG Ping,WU Ying-hua,HU Jin-fang

(DepartmentOtolaryngologyHeadandNeckSurgeryoftheFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China)

Objective To investigate the expression of microRNA-155 (miR-155) in serum of patients with allergic rhinitis.Methods Total RNA was extracted from the serum of allergic rhinitis patients and healthy subjects,and the expression of miR-155 was detected by real-time quantitative PCR.Results The total number of cells and the number of eosinophils in peripheral blood in allergic rhinitis patients were higher than those in healthy subjects.Moreover,serum expression of miR-155 in allergic rhinitis patients was 2.1 times as high as that in healthy subjects.Conclusion The miRNA-155 is highly expressed in serum of patients with allergic rhinitis.

allergic rhinitis; miRNA-155; serum; high expression

2016-08-20

江西省科技廳2011年計劃課題(20112BBG70046)

艾紅輝(1966—)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事耳鼻咽喉科疾病的臨床研究。

R765.21

A

1009-8194(2016)11-0064-02

10.13764/j.cnki.lcsy.2016.11.026