楊 潔 曹玉錦

(山東省棗莊市薛城奚仲中學(xué) 277000)(中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過程研究所 266101)

2016年5月2日，生物學(xué)領(lǐng)域頂尖刊物《自然-生物技術(shù)》發(fā)表了我國(guó)河北科技大學(xué)韓春雨等的研究成果《DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute》[1]，該論文提出一種新的基因組編輯技術(shù)NgAgo-gDNA。

1 什么是基因組編輯技術(shù)

基因組編輯技術(shù)(genome editing)是指對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)修飾的遺傳操作技術(shù)[2]。利用該技術(shù)，可以精確地定位到基因組的某一位點(diǎn)上，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定DNA片段的敲除、插入等操作。該技術(shù)通過在特定的靶向序列處引入斷裂的DNA雙鏈，繼而利用細(xì)胞自身的修復(fù)機(jī)制完成修復(fù)，從而達(dá)成修改并編輯原有的基因組的目的。與傳統(tǒng)的同源重組技術(shù)和胚胎干細(xì)胞技術(shù)相比，基因組編輯技術(shù)具有快速、操作便捷、成本較低等優(yōu)勢(shì)，為基因治療、生物遺傳改造等領(lǐng)域開辟了新的途徑。

基因組編輯技術(shù)迄今為止僅有20年左右的歷史，但在近十年取得突破性進(jìn)展，目前已提出的基因組編輯策略包括ZFN技術(shù)、TALEN技術(shù)、CRISPR/Cas9技術(shù)以及本文著重介紹的NgAgo-gDNA技術(shù)。

2 新一代基因組編輯技術(shù)——NgAgo-gDNA

NgAgo-gDNA是Natronobacterium gregoryi Argonaute - guide DNA的簡(jiǎn)稱，Natronobacterium gregoryi是格氏嗜鹽堿桿菌；Argonaute(Ago)是一種核酸內(nèi)切酶；gDNA 即向?qū)NA。2004年，荷蘭學(xué)者發(fā)現(xiàn)來自嗜熱菌的Ago可以有效地利用5′磷酸化的單鏈DNA作為gDNA，對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)切割造成其雙鏈斷裂[2](但該酶需要在>65°C的條件下才具有活性，限制了其在生物體中應(yīng)用的可能性)。韓春雨課題組在此基礎(chǔ)上，通過數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，找到了來自格氏嗜鹽堿桿菌的Ago(NgAgo)，該蛋白在生理?xiàng)l件下即具有很好的酶切活性，可以在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)gDNA介導(dǎo)的基因組的切割(圖1)，并且能夠?qū)崿F(xiàn)在基因組中插入目的DNA片段的能力，是一種高效快捷的基因組編輯工具[1]。

根據(jù)韓春雨課題組的研究結(jié)果，NgAgo-gDNA與CRISPR/Cas9技術(shù)相比具有以下特點(diǎn)：①向?qū)гO(shè)計(jì)制作簡(jiǎn)便：gDNA設(shè)計(jì)方便，可以像合成PCR引物一樣由公司合成，輸送方式直接，直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞：②編輯對(duì)象所受限制?。篊as9需要與基因組上19個(gè)堿基配對(duì)，并要求在這組堿基后緊鄰一個(gè)特定的PAM序列，一定程度上限制了靶位點(diǎn)的選擇范圍，而NgAgo-gDNA技術(shù)中靶位點(diǎn)的選擇則不受PAM序列的限制，幾乎能編輯基因組內(nèi)任何位置；③編輯精準(zhǔn)度更高：與NgAgo結(jié)合的gDNA長(zhǎng)度為24個(gè)堿基，這比與Cas9結(jié)合的19個(gè)堿基的gRNA要長(zhǎng)5個(gè)堿基，理論上其精確性可以提高45倍；NgAgo-gDNA系統(tǒng)對(duì)gDNA靶序列錯(cuò)配容忍度很低；同時(shí)，向?qū)Ш怂崾荄NA而非RNA，避免了RNA形成復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)而帶來的失效或者脫靶效應(yīng)。與CRISPR/Cas9技術(shù)相比，目前NgAgo-gDNA的劣勢(shì)在于：①無法使用質(zhì)?；蚵圆《据d體輸送gDNA；②gDNA不能再改造，而gRNA可以連接一段RNA不影響功能。

圖1 NgAgo-gDNA技術(shù)原理示意圖

3 NgAgo-gDNA技術(shù)的啟示

NgAgo-gDNA是我國(guó)學(xué)者首創(chuàng)的尖端生物技術(shù)，被譽(yù)為第四代基因組編輯技術(shù)，打破了國(guó)外基因組編輯技術(shù)的專利壟斷。但該技術(shù)還需要后續(xù)工作進(jìn)行驗(yàn)證和進(jìn)一步的改進(jìn)。