楊　舒，張　倩，馮　波，王明明，穆　祥

(北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室，北京 102206)

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黃芩水煎液中黃芩苷的HPLC測定及其抗內(nèi)毒素作用

楊舒，張倩，馮波，王明明，穆祥*

(北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室，北京 102206)

摘要：通過HPLC法分析黃芩水煎液中黃芩苷含量，采用顯色基質(zhì)法鱟試驗進(jìn)行相關(guān)單體成分的抗內(nèi)毒素定量測定。結(jié)果表明，黃芩水煎液中含量最多的單體成分為黃芩苷，顯色基質(zhì)法鱟試驗結(jié)果表明，不同濃度(50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL)的黃芩苷溶液對內(nèi)毒素的破壞率分別為45.08%、54.39%、57.45%、61.78% 和82.80%，其破壞率呈濃度依賴性，可知黃芩水煎液中含量最多的成分黃芩苷具有滅活內(nèi)毒素的作用。

關(guān)鍵詞：黃芩水煎液；黃芩苷；高效液相色譜；抗內(nèi)毒素

近年來，長期大量地使用抗生素誘生了很多的廣譜耐藥菌，殘留在動物性食品中的抗生素也日益增多，且抗生素在殺滅細(xì)菌的同時，往往會誘發(fā)內(nèi)毒素的釋放，從而引起內(nèi)毒素血癥，加重病情，導(dǎo)致革蘭陰性菌感染所致的病死率居高不下[1]。細(xì)菌內(nèi)毒素(endotoxin,ET)是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁最外層的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)成分[2]，內(nèi)毒素進(jìn)入機體后可引起機體的發(fā)熱反應(yīng)[3]以及血小板的黏附、聚集，觸發(fā)凝血系統(tǒng)，導(dǎo)致彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)[4]，還可引起全身性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory responses yndrome,SIRS)或膿毒癥(sepsis )[5]，并導(dǎo)致心肌損害、肺損傷、肝衰竭、腎衰竭、胃腸道損傷等多器官功能障礙(MODS)[6]等。因此，尋找能拮抗和破壞內(nèi)毒素的有效藥物已成為當(dāng)前國內(nèi)外研究的熱點之一。中醫(yī)將內(nèi)毒素致病歸為熱毒范疇，與溫病病因、病機辯證原則相吻合。中草藥被用來治療各種感染性疾病的歷史悠久，在多年的臨床上表明，清熱解毒中藥用于治療“熱毒”、“邪毒”有很好的療效。

黃芩為唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根，是我國具有代表性的清熱解毒中藥。其主產(chǎn)區(qū)有河北、遼寧、陜西、山東、內(nèi)蒙古、黑龍江等，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效[7]。黃芩中含有多種黃酮類衍生物，其主要成分有黃芩苷(baicalin )、黃芩素(scuteuarin)、漢黃芩苷(wogonoside)、漢黃芩素(wogonin)等[8-9]。而黃芩苷作為黃芩的主要化學(xué)成分，具有抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗病毒等廣泛的藥理作用[10-15]。本實驗室前期研究證明，黃芩水煎液具有良好的滅活內(nèi)毒素的能力。因此，本試驗建立了高效液相色譜測定黃芩苷的方法，對黃芩水煎液中的黃芩苷含量進(jìn)行了測定，并利用顯色基質(zhì)法鱟試驗對黃芩苷體外破壞內(nèi)毒素的作用進(jìn)行研究，為進(jìn)一步闡明黃芩苷清熱解毒的作用機制奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

Waters2695高效液相色譜系統(tǒng)、Waters2998光電二極管陣列檢測器、Empower 工作站，美國沃特世公司產(chǎn)品；Venusil MP C18(2)色譜柱(5 μm，150 mm×4.6 mm)，博納艾杰爾公司產(chǎn)品；Milipore水純化系統(tǒng)，美國密理博公司產(chǎn)品；R1002B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申順生物科技有限公司產(chǎn)品；CK-32A型全自動陶瓷保健壺，捷達(dá)家用電器廠產(chǎn)品；QL-901型漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；黃芩苷對照品，中國食品藥品檢定研究院產(chǎn)品；黃芩，北京同仁堂產(chǎn)品；甲醇、乙腈均為色譜純，塞默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；顯色基質(zhì)鱟試劑盒，Tris-緩沖液，廈門市鱟試劑實驗廠有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1黃芩水煎液中黃芩苷含量的測定

1.2.1.1色譜條件流動相A為6 g/L的磷酸溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫程序如下：0～30 min，80%～73%A，20%～27%B；流速1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL，柱溫25℃。

1.2.1.2對照品溶液制備精密稱取黃芩苷對照品10 mg，置于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成1 mg/mL的對照品溶液。

1.2.1.3供試品溶液制備準(zhǔn)確稱取黃芩50 g放入藥罐中，加入10倍體積水浸泡30 min。打開開關(guān)，調(diào)到快火，開始熬藥。待水沸騰后，將其調(diào)到慢火，維持沸騰30 min，冷卻至室溫，將藥液倒入大燒杯中。第2次加入8倍體積水，重復(fù)第1次過程。然后合并濾液，16層紗布粗濾，再用布氏漏斗真空抽濾，轉(zhuǎn)入另一干凈大燒杯中(保鮮膜封口)。將過濾后的藥液倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(每次不超過體積的1/3)，水浴溫度50℃，轉(zhuǎn)速60，將其濃縮至0.1 g生藥/mL，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過，取濾液，即得供試品溶液。

1.2.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取黃芩苷對照品溶液5、10、20、30、40、50 μL，注入色譜儀，記錄峰面積，以黃芩苷對照品進(jìn)樣量的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，峰面積的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，計算回歸方程，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.5精密度試驗精密吸取同一份對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次進(jìn)樣20 μL，測定峰面積，并計算其RSD。

1.2.1.6穩(wěn)定性試驗取同一份供試品溶液，分別于配制后0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣20 μL，測定峰面積，并計算其RSD。

1.2.1.7重復(fù)性試驗取同一批供試品樣品，按“1.2.1.3”中的方法制備6 份供試品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，測定峰面積，并計算其RSD。

1.2.1.8加樣回收率試驗精密量取已知含量的同一批樣品6 份，按“1.2.1.3”方法制備6 份供試品溶液，每份5 mL，分別精密加入5 mL黃芩苷對照品溶液，各取20 μL注入色譜儀，測定峰面積，計算加樣回收率。

1.2.1.9樣品含量的測定取3批黃芩樣品，按“1.2.1.3”制備樣品供試液，按“1.2.1.1”色譜條件進(jìn)行測定，以外標(biāo)兩點法計算黃芩苷含量。

1.2.2顯色基質(zhì)法鱟試驗對黃芩苷破壞內(nèi)毒素的定量測定

1.2.2.1黃芩苷溶液制備精密稱取黃芩苷對照品5 mg，置于100 mL容量瓶中，加內(nèi)毒素檢查用水(BET水)(提前預(yù)熱到30℃)和Tris-緩沖液溶解并定容至100 mL，制成濃度為50 μg/mL的供試品原液，渦旋5 min左右，使其充分溶解混勻。然后依次稀釋成濃度為25、12.5、6.25、3.125μg/mL的供試品溶液，每稀釋一次渦旋30 s。

1.2.2.2細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(10 EU/支)1支，每支準(zhǔn)確加入BET水1 mL，充分渦旋混合15 min，得濃度為10 EU/mL的細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，然后依次稀釋成濃度為5、1、0.5、0.25、0.1 EU/mL的內(nèi)毒素溶液，每稀釋1次渦旋30 s。

1.2.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取5支無熱原試管依次分別加入0.1 mLBET水、0.1、0.25、0.5、1 EU/mL的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別加入0.1 mL鱟試劑溶液，混勻，37℃孵育10 min。溫育結(jié)束后，分別加入0.1 mL顯色基質(zhì)溶液，混勻，37℃孵育6 min。溫育結(jié)束后，分別加入0.5 mL偶氮化試劑1，混勻；再分別加入0.5 mL偶氮化試劑2，混勻；再分別加入0.5 mL偶氮化試劑3，混勻，靜置5 min，吸取混合液至無熱源96孔板內(nèi)，于545 nm波長處讀取吸光度值。每個樣品重復(fù)4孔，求取平均值。以內(nèi)毒素濃度(EU/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，計算回歸方程。

1.2.2.4黃芩苷對內(nèi)毒素破壞率的測定取8支無熱原試管依次分別加入0.05 mL不同濃度(50、25、12.5、6.25、3.125μg/mL)的供試品，分成試驗組和對照組，每組4管。試驗組每管分別加入0.05 mL 5 EU/mL內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，對照組每管分別加入等量的BET水，混勻，37℃孵育60 min。溫育結(jié)束后，分別加入0.1 mL鱟試劑溶液，混勻，37℃孵育10 min。溫育結(jié)束后，分別加入0.1 mL顯色基質(zhì)溶液，混勻，37℃孵育6 min。溫育結(jié)束后，分別加入0.5 mL偶氮化試劑1，混勻；再分別加入0.5 mL偶氮化試劑2，混勻；再分別加入0.5 mL偶氮化試劑3，混勻，靜置5 min，吸取混合液至無熱源96孔板內(nèi)，于545 nm波長處讀取吸光度值。每個樣品重復(fù)4孔，求取ΔOD值(ΔOD = OD試驗組-OD對照組 )，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算內(nèi)毒素含量，然后利用公式：內(nèi)毒素破壞率=(5-內(nèi)毒素含量)/5×100%，計算內(nèi)毒素破壞率。

2結(jié)果

2.1黃芩水煎液中黃芩苷的含量測定

2.1.1液相條件 試驗中采用6 g/L的磷酸溶液-乙腈作為流動相，在此條件下黃芩苷與相鄰色譜峰的分離效果良好，并且藥物的峰形對稱，沒有拖尾現(xiàn)象。按此色譜條件測得黃芩水煎液樣品和黃芩苷對照品的色譜圖見圖1和圖2。

圖1　黃芩水煎液樣品的HPLC色譜圖

圖2　黃芩苷對照品的HPLC色譜圖

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以黃芩苷對照品進(jìn)樣量的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，峰面積的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，黃芩苷含量測定的回歸方程為y=0.949 3x+6.574 5，r =0.999 6，說明黃芩苷在5 μg～50 μg 范圍內(nèi)，峰面積的對數(shù)值與黃芩苷對照品進(jìn)樣量的對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系(圖3)。

圖3　黃芩苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.3精密度試驗 黃芩苷峰面積的RSD為1.37%，說明儀器精密度良好。

2.1.4穩(wěn)定性試驗 供試品24 h 內(nèi)峰面積RSD為1.29%，說明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5重復(fù)性試驗 黃芩苷的平均含量(n=6)為3.125 g/kg，6份供試品峰面積RSD為0.93%，說明方法重復(fù)性良好。

2.1.6加樣回收率試驗 6份樣品中黃芩苷的平均回收率為100%，RSD為1.40%，說明回收率良好。

2.1.7樣品含量的測定 3批黃芩中的黃芩苷含量見表1，其平均值為3.14 g/kg，RSD為1.27%，說明該測定方法準(zhǔn)確、可靠，可用于測定黃芩水煎液中的黃芩苷含量。

表1　黃芩水煎液中黃芩苷含量的測定結(jié)果

2.2顯色基質(zhì)法鱟試驗對黃芩苷破壞內(nèi)毒素定量測定

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以內(nèi)毒素濃度(EU/mL)為橫坐標(biāo)，以545 nm吸光度值為縱坐標(biāo)，計算回歸方程為y=0.056 5x+0.001 1，r =0.986 1。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。說明內(nèi)毒素濃度在0.1 EU/mL～1.0 EU/mL與吸光度值之間呈線性相關(guān)。

2.2.2黃芩苷對內(nèi)毒素破壞率的測定 不同濃度黃芩苷對內(nèi)毒素的破壞率結(jié)果見表2，可知隨著黃芩苷濃度的增高，其對內(nèi)毒素的破壞率不斷增加，當(dāng)

黃芩苷濃度為50 μg/mL的時候，對內(nèi)毒素的破壞率可達(dá)到82.8%，并且這種破壞作用呈濃度依賴性。

圖4　特異性顯色基質(zhì)法標(biāo)準(zhǔn)曲線

組別Groups50/(μg·mL-1)25/(μg·mL-1)12.5/(μg·mL-1)6.25/(μg·mL-1)3.125/(μg·mL-1)對照組OD值ODvaluesofcontrolgroup0.0814±0.006140.0583±0.001230.0562±0.002700.0551±0.000380.0528±0.00240試驗組OD值ODvaluesofexperimentalgroup0.1292±0.000880.1688±0.001380.1796±0.002000.1876±0.000520.2131±0.00737ΔOD值ΔODvalues0.12920.11050.12340.13250.1603內(nèi)毒素含量/(EU·mL-1)ContentofET0.8591.9112.1282.2822.747內(nèi)毒素破壞率/%ETdamagerate82.8061.7857.4554.3945.08

3討論

3.1色譜條件的選擇

在色譜條件優(yōu)化過程中，流動相考察了甲醇-水-醋酸系統(tǒng)[16]，甲醇-水- 磷酸系統(tǒng)[17]，乙腈-水-醋酸系統(tǒng)以及乙腈-水-磷酸系統(tǒng)。黃芩苷的結(jié)構(gòu)為5，6-二羥基酮-7-0葡萄糖醛酸苷，可以通過在流動相中加入磷酸來抑制其解離[18]，防止色譜峰拖尾，從而改善峰形。經(jīng)比較，乙腈-水- 磷酸系統(tǒng)較好，在此條件下出峰時間合適，黃芩水煎液中各成分能夠得到較好的分離。

本試驗通過建立高效液相色譜法分析黃芩水煎液中的水溶性化學(xué)成分，并測定了其中黃芩苷的含量。試驗結(jié)果表明，本方法簡單，準(zhǔn)確、靈敏、重現(xiàn)性好，為評價黃芩質(zhì)量提供了相關(guān)依據(jù)，同時保證了本試驗測試成分選取的正確性。

3.2顯色基質(zhì)法鱟試驗成分的選取

由圖1～圖2可知，在黃芩苷對照品色譜峰的相應(yīng)位置上，供試品溶液具有相同保留時間的色譜峰，出峰時間一致，說明黃芩水煎液中含有黃芩苷并且不同批次黃芩中黃芩苷含量均為最高。考慮到抗內(nèi)毒素的效果及后續(xù)產(chǎn)品的開發(fā)，本試驗選取黃芩水煎液中含量最高的中藥單體成分黃芩苷用于顯色基質(zhì)法鱟試驗。

3.3黃芩苷抗內(nèi)毒素作用

目前，抗生素作為抗菌助長劑添加到飼料中，對控制畜禽疾病的發(fā)生，促進(jìn)畜禽生長發(fā)育，提高飼養(yǎng)效益確實起到積極的作用。抗生素是通過滅活飼料中的細(xì)菌，減少細(xì)菌內(nèi)毒素的釋放，從而減輕對機體的傷害，保證機體的正常發(fā)育。但是長期、大量地使用抗生素也產(chǎn)生很多問題，比如誘生了很多的廣譜耐藥菌、殘留在動物類食品中的抗生素也日益增多等，世界各國都陸續(xù)開始限制或禁止將抗生素添加在飼料里。因此，我們想要尋找一種能夠滅活細(xì)菌內(nèi)毒素，部分代替抗生素的藥物作為飼料添加劑來觀察是否可以維持動物正常生長。

鱟試劑是FDA認(rèn)可的LPS 檢測試劑，也是目前最常用的細(xì)菌LPS檢測試劑[19]。顯色基質(zhì)法鱟試劑靈敏度高，專一性強，采用此法來檢測中藥成分抗細(xì)菌內(nèi)毒素作用，方法簡易、快捷。其作用原理為細(xì)菌內(nèi)毒素通過激活鱟試劑中的C因子，引起一系列酶促反應(yīng)，最終使鱟試劑中的凝固酶原轉(zhuǎn)化為凝固酶，該酶可以分解人工合成的顯色基質(zhì)，使其分解為多肽和黃色的對硝基苯胺(pNA，λmax = 405 nm)。在一定時間內(nèi)，pNA的生成量與細(xì)菌內(nèi)毒素濃度成正相關(guān)，據(jù)此，可以定量檢測內(nèi)毒素的濃度。 但影響該法的因素較多，尤其是反應(yīng)液的pH。因此，本試驗采用pH6.0～8.0的Tris緩沖液處理黃芩苷溶液，以避免pH對鱟試劑的影響。試驗結(jié)果顯示，濃度為3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL的黃芩苷對內(nèi)毒素的破壞率分別為45.08%、54.39%、57.45%、61.78% 和82.80%。說明不同濃度的黃芩苷能不同程度地破壞內(nèi)毒素且黃芩苷溶液破壞內(nèi)毒素的作用具有濃度依賴性，濃度越大，滅活內(nèi)毒素作用越強。以上結(jié)果提示，黃芩苷可能是黃芩拮抗內(nèi)毒素作用的主要成分，為今后對黃芩苷破壞內(nèi)毒素機制的研究以及對動物飼料添加劑的選取奠定了基礎(chǔ)。

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Determination of Baicalin Component from Water Decoction ofScutellariae

baicalensisby HPLC and Study on Anti-endotoxin Effects of Baicalin

YANG Shu,ZHANG Qian,FENG Bo,WANG Ming-ming,MU Xiang

(BeijingAgricultureCollegeBeijingKeyLaboratoryofTCVM,Beijing,102206,China)

Abstract:The components of baicalin from the water decoction of Scutellariae baicalensis were determined by HPLC,the limulus test was adopted to make a quantitative determination of the related monomer components.The results of HPLC showed that the most component of the water decoction of Scutellariae baicalensisis baicalin.The result of the limulus test showed that different concentrations of baicalin( 50,25,12.5,6.25,3.125 μg/mL) had different destruction percentages of 45.08%,54.39%,57.45%,61.78% and 82.80% to endotoxixin,respectively,its destruction percentage by baicalin was in a dose-dependent manner.Then the major components of baicalin from the water decoction of Scutellariae baicalensishad anti-endotoxin effects.

Key words:water decoction of Scutellariae baicalensis;baicalin;HPLC;anti-endotoxin

文章編號:1007-5038(2016)03-0047-05

中圖分類號:S858.74

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

作者簡介：楊舒(1989-)，女，河南鄭州人，碩士研究生，主要從事中獸醫(yī)學(xué)研究。*通訊作者

基金項目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技成果惠民科技示范工程項目(Z121100007412004)；“十二五”國家支撐計劃(2011BAD34B03-5)；國家自然科學(xué)基金項目(31272144)

收稿日期：2015-09-18