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犬源大腸埃希菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥表型和耐藥基因檢測(cè)

摘要:為研究犬源大腸埃希菌的耐藥情況，對(duì)成都地區(qū)采集的犬肛門拭子進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，共分離156株大腸埃希菌,同時(shí)，進(jìn)行5種抗生素耐藥性檢測(cè)和β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥基因的菌株篩選。結(jié)果顯示，大腸埃希菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類耐藥率較高，頭孢喹肟100%，氨芐西林73.1%，但對(duì)美羅培南敏感率高達(dá)95.5%。采用PCR方法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺類藥物常見的3種耐藥基因blaCTX-M、blaSHV和blaTEM，blaCTX-M檢出率最高為89.74%, blaTEM為78.84%，blaSHV無檢出。耐藥性和耐藥基因比較表明,犬源大腸埃希菌β-內(nèi)酰胺類的耐藥性與耐藥基因型檢出率基本呈正相關(guān)，為成都犬源大腸埃希菌β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥現(xiàn)狀和疾病治療提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞:犬；大腸埃希菌；β-內(nèi)酰胺類耐藥基因；耐藥性

大腸埃希菌(Escherichiacoli)廣泛分布于自然界和犬腸道內(nèi)，主要因飼養(yǎng)管理不當(dāng)、天氣驟變而引起疾病。臨床上以腹瀉和尿路感染常見[1-2],隨著β-內(nèi)酰胺類藥物的廣泛應(yīng)用，耐藥的相關(guān)報(bào)道屢見不鮮。犬?dāng)y帶的耐藥菌很可能通過接觸傳播給人類[3]，從而引起嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。我國流行的β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥基因主要為blaTEM、blaSHV、blaCTX-M[4]。本試驗(yàn)對(duì)成都地區(qū)分離的156株犬源大腸埃希菌進(jìn)行最小抑菌濃度測(cè)定(MIC)，了解犬源大腸埃希菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥情況，并采用PCR方法為大腸埃希菌耐藥性的快速檢測(cè)及耐藥基因的分子流行病學(xué)調(diào)查提供手段。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品來源2014年5月到8月，從成都市4家寵物醫(yī)院采集健康或患病犬肛拭子共175份，并立即送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定。

1.1.2藥品和試劑 2×TaqMaster Mix，購自北京天根生物科技公司；大腸埃希菌顯色培養(yǎng)基，購自鄭州博賽生物有限公司；麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基和MH肉湯，購自青島海博生物試劑有限公司；質(zhì)控大腸埃希菌ATCC25922，由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供; 氨芐西林、美羅培南，購自中國食品藥品檢定研究院；頭孢喹肟，購自中國獸醫(yī)藥

品監(jiān)察所；PCR儀，購自蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司；電泳凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌分離鑒定無菌將樣品接種于含LB肉湯EP管中，37℃培養(yǎng)過夜。然后用接種環(huán)蘸取菌液劃線在麥康凱瓊脂平板和伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，觀察結(jié)果。將可疑菌落進(jìn)行革蘭染色、鏡檢。并取純化菌落于大腸埃希菌顯色培養(yǎng)基進(jìn)行鑒定。

1.2.2藥敏試驗(yàn)采用測(cè)定最小抑菌濃度(MIC)方法[5]，對(duì)156株大腸埃希菌進(jìn)行氨芐西林、頭孢喹肟、美羅培南3種藥物藥敏試驗(yàn)，同時(shí)用大腸埃希菌 ATCC25922作為質(zhì)控菌株 ，每種抗生素做3個(gè)重復(fù)，以未變渾濁的最后1孔所對(duì)應(yīng)的藥物濃度作為該藥的最小抑菌濃度。耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)參考美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)推薦的操作程序和標(biāo)準(zhǔn)(NCCLS，2014)進(jìn)行[6]。

1.2.3細(xì)菌β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥基因PCR檢測(cè)根據(jù)文獻(xiàn)[7]已發(fā)表β-內(nèi)酰胺類藥物常見耐藥基因blaCTX-M、blaSHV和blaTEM基因序列(表1)。用酚-氯仿方法提取DNA。采用25 μL PCR反應(yīng)體系：2×TaqMaster Mix為12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，用ddH2O補(bǔ)至25 μL；PCR引物合成和測(cè)序均由上海生工生物工技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

表1　引物信息

2結(jié)果

2.1細(xì)菌形態(tài)及染色特性

該菌在麥康凱瓊脂上可形成紅色不透明中等大

小光滑菌落，在伊紅美藍(lán)瓊脂上形成紫黑色且?guī)Ы饘俟鉂傻膯蝹€(gè)菌落。在顯色培養(yǎng)基可形成藍(lán)綠色中等大小的菌落。挑取單菌落染色鏡檢可見，革蘭染色陰性(即紅色)、中等大小、兩端鈍圓的短桿菌[8]。根據(jù)培養(yǎng)特性、革蘭染色有156株符合大腸埃希菌特征。

2.2藥敏試驗(yàn)結(jié)果

156株犬源大腸埃希菌對(duì)第4代動(dòng)物專用頭孢類抗生素頭孢喹肟耐藥率為100%，氨芐西林耐藥率為73.1%， 但對(duì)美羅培南敏感性很高(95.5%)，針對(duì)大腸埃希菌治療效果最佳，對(duì)5種β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的耐藥情況見表2。

表2　犬源大腸埃希菌對(duì)抗生素的敏感性

2.3β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥基因PCR檢測(cè)結(jié)果

對(duì)臨床分離的156株犬源大腸埃希菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，blaCTX-M、blaSHV均獲得與預(yù)期目的片段大小相符的擴(kuò)增條帶，所有菌株均未擴(kuò)增出blaSHV型條帶。blaCTX-M陽性率為89.74%(140/156)，blaTEM陽性率為78.84%(123/156)，blaSHV無檢出,部分菌株耐藥基因檢測(cè)結(jié)果見圖1和圖2。

2.4耐藥表型與耐藥基因的相關(guān)性

對(duì)156株犬源大腸埃希菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，114株對(duì)氨芐西林耐藥，約占73．1%，156株對(duì)頭孢喹肟全部耐藥，耐藥率為100%，7株對(duì)美羅培南耐藥，約占4.5%。與本次檢測(cè) β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥表型和耐藥基因符合率的比較結(jié)果見表3。 符合率從高到低依次為頭孢喹肟(89.74%) 、氨芐西林 (78.84%) 、美羅培南(0 )。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；N．陰性對(duì)照；1～6．臨床分離株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000；N.Negative control； 1-6．PCR products of clinical isolates

圖1部分菌株 blaCTX-M基因檢測(cè)結(jié)果

Fig.1The results of blaCTX-Mgenes detected from a part of strains

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；N．陰性對(duì)照；1～6．臨床分離株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物

M．DNA Marker DL 2 000；N.Negative control；1-6．PCR products of clinical isolates

圖2　部分菌株blaTEM基因檢測(cè)結(jié)果

3討論

當(dāng)前犬源大腸埃希菌的耐藥性逐漸增強(qiáng)，與2007年—2008年何柳等[9]報(bào)道結(jié)果相比，犬源大腸埃希菌對(duì)頭孢喹肟的耐藥率已明顯升高，對(duì)氨芐西林的耐藥率持平，156株犬源大腸埃希菌對(duì)頭孢喹肟、氨芐西林耐藥性較高，耐藥率均在50%以上?？赡苁桥R床治療大腸埃希菌感染濫用抗生素和無指征用藥的緣故，導(dǎo)致細(xì)菌在抗生素選擇性壓力下出現(xiàn)耐藥[10]。而且犬源大腸埃希菌對(duì)這些抗生素出現(xiàn)高耐藥率勢(shì)必對(duì)公共衛(wèi)生造成嚴(yán)重威脅。

156株犬源大腸埃希菌攜帶β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因blaCTX-M檢出陽性率為89.74%(140/156)，blaTEM檢出陽性率為78.84%(123/156)，blaSHV無檢出, 而底麗娜等[11]報(bào)道新疆地區(qū)203株豬源大腸埃希菌耐藥基因blaCTX-M檢出陽性率為0.99%(2/203)，blaTEM檢出陽性率為40.89%(83/203)，耐藥基因檢出率有顯著差異可能與菌株的來源和抗生素使用頻率等原因有關(guān)[12]。

β-內(nèi)酰胺類耐藥表型和耐藥基因檢測(cè)結(jié)果符合率基本呈正相關(guān)。而表2中美羅培南耐藥菌株未檢出blaSHV耐藥基因，但卻表現(xiàn)了耐藥性，有些菌株攜帶1種或2種耐藥基因，但未表現(xiàn)出耐藥性。這些情況出現(xiàn)可能耐藥基因未能得到有效表達(dá)或攜帶其他耐藥基因；從而未能發(fā)揮出其耐藥的功能[13]。而目前細(xì)菌藥敏試驗(yàn)檢測(cè)耗時(shí)較長，而臨床治療在未得到藥敏結(jié)果時(shí)往往按照經(jīng)驗(yàn)用藥[14]。分子水平的檢測(cè)結(jié)果和耐藥表型有較好的相關(guān)性，有望成為一種新的耐藥性診斷方法。

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Detection of Drug Resistance Patterns and Drug Resistance Genes ofE.coliIsolated from Dogs to β-lactam Antibiotics

WEN Juan1，YANG Xiao-nong1,ZHU Zi-feng2,JI Hui-shu1,XU Xiao-tong1

(1.CollegeofLifeScienceandTechnology,SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu,Sichuan,610041,China；2.ThehospitalofSouthwestUniversityforNationalities，Chengdu，Sichuan,610041,China)

Abstract:In order to investigate the drug resistance of Escherichia coli derived from dogs in Chengdu,the anal swabs were collected for isolation and identification of E.coli.The results showed that 156 E.coli strains were isolated.And then the drug resistance of 5 kinds of antibiotics and strain screening of β-lactams drug resistance genes were detected.The results showed that the resistance rates to β-lactam antibiotics were high:Cefquinome(100%),ampicillin (73.1%),and with the highest sensitive rate to meropenem (95.5%).Finally,there were 3 kinds of the common resistance genes blaCTX-M,blaSHV and blaTEMof β-lactam antibiotics were tested.The result showed that the blaCTX-Mgene had the highest rate(89.74%),the next was blaTEMgene (78.84%),and the blaSHV gene was not detected.The result showed that there was a positive correlation between the drug resistance and the detection rate of the drug resistance genotype to β-lactam antibiotics.This study provided a theoretical basis for drug resistance status of β-lactam antibiotics in dogs of Chengdu,and it also may play a important role in disease treatment.

Key words:dog;Escherichia coil；β-lactamase resistance gene；drug resistance

文章編號(hào):1007-5038(2016)03-0078-03

中圖分類號(hào):S852.612

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

作者簡(jiǎn)介：文娟(1988-)，女，四川南部人，碩士研究生，主要從事小動(dòng)物疾病研究。 *通訊作者

收稿日期：2015-06-30

文娟1，楊曉農(nóng)1*，朱子鳳2，徐小桐1，計(jì)慧姝1

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041；2.西南民族大學(xué)校醫(yī)院，四川成都 610041)