孫小祥， 譚才宏， 陳 鈞， 張業(yè)旺， 夏國(guó)華*（1.鎮(zhèn)江市中醫(yī)院藥劑科，江蘇鎮(zhèn)江100；.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江101；.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，江蘇鎮(zhèn)江1001）

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基于殼仁分離的水飛薊提取純化工藝

孫小祥1，2， 譚才宏3， 陳 鈞2， 張業(yè)旺2， 夏國(guó)華2*
（1.鎮(zhèn)江市中醫(yī)院藥劑科，江蘇鎮(zhèn)江212003；2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；3.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

摘要：目的 研究在殼仁分離條件下，以水飛薊制備純化水飛薊賓的工藝。方法 水飛薊脫殼后，其殼的乙酸乙酯提取物用乙醇洗脫純化，并以水飛薊賓純度和得率為指標(biāo)，采用中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化工藝。結(jié)果 最佳條件是以80%乙醇為洗脫溶劑，液固比1.1，洗脫4次，所得水飛薊賓純度為82%，得率為80%。70%乙醇重結(jié)晶后，其含有量為97.3%，產(chǎn)率為1.090%。結(jié)論 該工藝可提高水飛薊的綜合利用，而且簡(jiǎn)單可行，成本低廉，具有很好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：水飛薊；水飛薊賓；殼仁分離；中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法

中藥水飛薊Silybi Fructus為菊科水飛薊屬植物水飛薊Silybum marianum（L.）Gaertn的干燥成熟瘦果，作為經(jīng)濟(jì)作物，由德國(guó)引種入我國(guó)，并被《中國(guó)藥典》收錄［1］。其主要有效成分水飛薊賓（si1ybin，SLB）為理想的肝損傷修復(fù)藥物［2-3］，市場(chǎng)需求量極大，目前已經(jīng)有水飛薊賓片劑、膠囊、脂質(zhì)體等多種制劑上市。

水飛薊的果皮（水飛薊殼）與種仁（水飛薊仁）比重接近，但在化學(xué)成分和生物活性上有很大的差異［4-6］，水飛薊賓主要分布于果皮中，而在種仁中的含有量極低［7］，但水飛薊瘦果果皮堅(jiān)硬，對(duì)種仁包裹緊密，脫殼困難。目前，生產(chǎn)上主要是將水飛薊冷軋取油，以壓榨后的水飛薊粕提取水飛薊素，進(jìn)一步純化后得到水飛薊賓［8］，但該工藝提取率低，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，單位能耗高［9］。因此，為了實(shí)現(xiàn)水飛薊資源的高效綜合利用，本實(shí)驗(yàn)以水飛薊的殼仁分離技術(shù)為基礎(chǔ)，建立一種新型的提取純化工藝，為制藥工業(yè)中水飛薊賓的生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 水飛薊脫殼機(jī)（本實(shí)驗(yàn)室專利［10］）；TG328A電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；I-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；UV2401紫外-可見分光光度計(jì)、LC-20A HPLC色譜儀（日本Shimadzu公司）。

1.2 材料 水飛薊藥材（江蘇中興藥業(yè)有限公司），由江蘇大學(xué)藥學(xué)院陳紅霞副教授鑒定為菊科植物水飛薊Silybum marianum（L.）Gaertn的干燥成熟果實(shí)，標(biāo)本（編號(hào)SP20121101）保存于江蘇大學(xué)藥學(xué)院標(biāo)本室。水飛薊賓對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)0856-201203，經(jīng)HPLC測(cè)定，純度≥98%）。甲醇為色譜純（江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 水飛薊賓含有量測(cè)定［1，11］

2.1.1 溶液配制 精密稱取水飛薊賓對(duì)照品32.0 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容，即得對(duì)照品貯備液。再精密稱取水飛薊賓粗品或精制品35.0 mg，置于50 mL量瓶中，甲醇定容，即得供試品溶液。

2.1.2 色譜條件 Venusi1ASB C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇-2.0%冰醋酸水溶液（45∶55）；進(jìn)樣量20 μL；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)288 nm；柱溫室溫。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密吸取貯備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置于25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，進(jìn)樣測(cè)定。以質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y＝61 043X-20 548，r＝0.999 5，表明水飛薊賓在1.888～11.328 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 樣品測(cè)定 精密吸取樣品溶液5.0 mL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作。

2.2 水飛薊瘦果殼仁分離 取干燥的水飛薊藥材3 kg，以1 kg/m in的速率勻速加入脫殼機(jī)中，200目尼龍袋在出料口收集脫出物。將其用16目篩除去粉碎物后（稱定質(zhì)量，計(jì)算粉碎率），振動(dòng)篩選出未脫殼的藥材（稱重，計(jì)算脫殼率），再經(jīng)風(fēng)選以實(shí)現(xiàn)殼與仁的分離，備用。

2.3 水飛薊賓粗提物制備 將水飛薊殼粉碎，過40目篩，精密稱取15.0 g，加乙酸乙酯90 mL，80℃回流2 h，抽濾，濾渣同法再提取一次，合并濾液，減壓濃縮回收溶劑，石油醚（60～90℃）洗滌浸膏2次，揮干石油醚，即得［12］。

2.4 粗提物的純化 精密稱取水飛薊賓粗提物5.0 g，加入一定比例的乙醇溶液，渦旋1 min，靜置5 min后離心，烘干離心固體，稱定質(zhì)量，HPLC法測(cè)定水飛薊賓的純度，得到優(yōu)質(zhì)的水飛薊提取物原料（水飛薊素）或水飛薊賓原料中間體。

根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理，以Z（水飛薊賓的得率× 50%＋水飛薊賓的純度×50%）為響應(yīng)值，以影響SLB純化的乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比為自變量，進(jìn)行兩因素五水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)［13］，結(jié)果見表1。

表1 試驗(yàn)因素和水平

2.5 水飛薊賓精制 取水飛薊賓原料中間體5.0 g，加無水乙醇200 mL，加熱回流3 h溶解，緩慢加入微沸水86 mL稀釋后，繼續(xù)回流1 h，放冷，4℃冰箱放置過夜，離心，收集析出物，60℃下烘干。按比例重復(fù)上述過程，HPLC法測(cè)定水飛薊賓含有量，按下式計(jì)算產(chǎn)率。

2.6 對(duì)比試驗(yàn)［12］取水飛薊原藥材50 g，按照傳統(tǒng)冷軋?zhí)崛」に囍苽渌w薊賓。另取原藥材冷軋去油，得到水飛薊粕后，參照本工藝同法操作，計(jì)算產(chǎn)率，并與本工藝進(jìn)行比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 HPLC色譜圖 按“2.1.3”和“2.1.4”項(xiàng)下方法操作，得到水飛薊賓對(duì)照品、粗提物和精制品的HPLC色譜圖，見圖1。

圖1 水飛薊賓產(chǎn)物HPLC圖

3.2 殼仁分離效果 采用自制水飛薊脫殼機(jī)，脫殼率95%以上，粉碎率小于3%，脫殼效果見圖2。

圖2 水飛薊脫殼效果圖

3.3 響應(yīng)面優(yōu)化純化工藝 試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 試驗(yàn)結(jié)果

采用Design Expert 8.05軟件，對(duì)表中的Z項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸方程Z＝-2.185 9＋1.435 1A＋0.056 2B＋0.010 1AB-1.035 8A2-0.000 4B2。方差和可信度分析見表3、表4。

表3 方差分析結(jié)果

表4 回歸方程可信度分析

由表3、表4可知，該模型失擬項(xiàng)顯著（P＜0.05），而決定系數(shù)（P＞0.05）不顯著，說明方程的擬合度和可信度均良好。另外，因素A、A2、B2對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著，而B和交互項(xiàng)AB影響不顯著，故該模型可用于水飛薊粗提物的純化。

由響應(yīng)面分析圖（圖3）可知，水飛薊提取物的最佳純化工藝為79.39%乙醇，液固比1.08，洗脫4次。

圖3 響應(yīng)面分析圖

以80%乙醇為洗脫溶劑，液固比1.1，洗脫4次，平行3次進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表5，得Z值為0.819 8 （ISD為0.13%），接近預(yù)測(cè)值0.820 2，說明該模型可靠。在該工藝條件下，水飛薊賓純度為82%，得率為80%，故可作為優(yōu)質(zhì)的水飛薊提取物原料或水飛薊賓中間體產(chǎn)品。

表5 模型驗(yàn)證試驗(yàn)

3.4 水飛薊賓精制結(jié)果 取最優(yōu)工藝下3批水飛薊賓中間體原料，按“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行重結(jié)晶操作，結(jié)果見表6。

表6 高純度水飛薊賓精制結(jié)果

3.5 對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果 按照本工藝操作，從50 g水飛薊原藥材中制備的水飛薊賓產(chǎn)率為1.18%，而傳統(tǒng)工藝下為0.73%。

4 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)比較了硅膠柱色譜層析法、D101大孔吸附樹脂法和重結(jié)晶法對(duì)水飛薊賓粗提物精制的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硅膠柱色譜精制水飛薊賓的純度最高，但是需用大量溶劑，成本較高，產(chǎn)率較低，而大孔吸附樹脂的純度較低。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇重結(jié)晶法。

水飛薊賓常用的重結(jié)晶溶劑一般有甲醇、乙酸乙酯、丙酮以及混合溶劑系統(tǒng)，其中以甲醇和乙醇的精制產(chǎn)率為高［9］，考慮到甲醇的毒性，本實(shí)驗(yàn)選擇乙醇作為重結(jié)晶溶劑。研究發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯粗提物雜質(zhì)在無水乙醇中的溶解度遠(yuǎn)大于水飛薊賓，兩者的質(zhì)量濃度近似呈現(xiàn)5∶1～6∶1的關(guān)系。同時(shí)，水飛薊賓在70%乙醇中的溶解度較低（13.23 mg/mL），而該溶劑對(duì)雜質(zhì)仍有理想的溶解能力（70.71 mg/mL）。因此，結(jié)晶時(shí)先用無水乙醇溶解水飛薊賓粗品中的雜質(zhì)成分及部分水飛薊賓，再加水形成70%乙醇，使水飛薊賓的溶解度降低，進(jìn)而析出該成分，而雜質(zhì)成分未達(dá)到飽和，并不析出，以達(dá)到除雜的目的。

另外，本實(shí)驗(yàn)對(duì)純化后的乙醇洗脫液進(jìn)行LC-MS分析，發(fā)現(xiàn)其中含有二氫槲皮素、水飛薊亭、水飛薊寧、水飛薊賓、異水飛薊賓等成分，為后續(xù)從該結(jié)晶液中回收各活性單體提供參考。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)將中藥水飛薊脫殼后，制備優(yōu)質(zhì)的水飛薊提取物和高純度水飛薊賓，該工藝以水飛薊綜合利用為宗旨，簡(jiǎn)單可行，成本低廉，具有較高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

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*通信作者：夏國(guó)華，男，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)橹兴幪崛〖胺蛛x。E-mai1：xgh-78131@yeah.net

作者簡(jiǎn)介：孫小祥（1972—），男，碩士，副主任藥師，研究方向?yàn)樯庂Y源。E-mai1：412354487@qq.com

基金項(xiàng)目：鎮(zhèn)江市科技計(jì)劃項(xiàng)目（HS2014069）；江蘇省藥學(xué)會(huì)—百特生物藥學(xué)基金（201543）

收稿日期：2015-03-17

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.046

中圖分類號(hào)：I284.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1001-1528（2016）02-0686-04