董 禮， 干建偉， 李 梅， 吳建國（雅安三九藥業(yè)有限公司，四川雅安625000）

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HPLC法快速測定參麥注射液指紋圖譜

董 禮， 干建偉， 李 梅， 吳建國
（雅安三九藥業(yè)有限公司，四川雅安625000）

摘要：目的 采用HPLC法，快速測定參麥注射液（紅參、麥冬）指紋圖譜。方法 分析采用Waters X-BridgeTMBEH Shie1d IP18色譜柱（4.6 mm×100 mm，2.5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫；體積流量為2 mL/min；檢測波長為230 nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為4 μL。檢測10批參麥注射液，比較快速測定法與法定標(biāo)準(zhǔn)法的分析結(jié)果。結(jié)果 快速測定法與法定標(biāo)準(zhǔn)法的相似度基本一致。結(jié)論 該方法快速、準(zhǔn)確、可靠，可取代法定標(biāo)準(zhǔn)中的指紋圖譜檢測法。關(guān)鍵詞：參麥注射液；指紋圖譜；相似度；HPLC

KEY W 0RDS：Shenmai Injection；fingerprint；simi1arity；HPLC

中藥的化學(xué)成分復(fù)雜，很難使用一種或幾種方法對(duì)其進(jìn)行完全定量分析，而中藥化學(xué)指紋圖譜分析是對(duì)中藥及其制劑進(jìn)行綜合宏觀分析的有效方法之一［1］。2000年國家藥品監(jiān)督管理局頒布文件，要求對(duì)中藥注射液建立藥材和制劑的指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)［2］。參麥注射液是以紅參、麥冬為原料，經(jīng)科學(xué)組方、合理配制、去除雜質(zhì)后制成的中藥復(fù)方注射劑，具有益氣固脫、養(yǎng)陰生津、生脈的功效［3］，臨床上多用于治療氣陰兩虛型休克、冠心病、病毒性心肌炎、慢性肺心病、粒細(xì)胞減少癥［4-5］，該品種的新標(biāo)準(zhǔn)于2011年3月2日，由國家藥典委員會(huì)審定，國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布執(zhí)行［6］，在原標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上增加了指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)，對(duì)其質(zhì)量穩(wěn)定性、有效性的控制起著十分重要的作用。但該標(biāo)準(zhǔn)具有分析時(shí)間長的缺陷，難以保證分析過程中樣品的穩(wěn)定性。目前，化學(xué)指紋圖譜的分析工具大多為高效液相色譜（HPLC）［7-9］，近年來關(guān)于超高效超快速液相色譜（UPLCUHPLC）的應(yīng)用研究越來越多，其具有分析速度快、檢測靈敏、結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)［10］，但因其價(jià)格昂貴，從而增加了分析成本。因此，利用傳統(tǒng)的HPLC法，在保證分析結(jié)果準(zhǔn)確的前提下，如何提高分析效率，是本實(shí)驗(yàn)研究的主要目的，從而為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步優(yōu)化和建立提供依據(jù)。

1 儀器與材料

G1311B Agi1ent1260高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；XA205DU電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Mi11ipore Q純水系統(tǒng)（美國密理博公司）。

中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2.0版）軟件（國家藥典委員會(huì)頒布）；Microsoft Office Exce12007軟件（美國微軟公司）；Medca1c統(tǒng)計(jì)軟件（美國統(tǒng)計(jì)協(xié)會(huì)）。人參皂苷Ig1（批號(hào)110703-200726）、Ie（批號(hào)110754-200822）、Ib1（批號(hào)110704-200420）均購于中國食品藥品檢定研究院。參麥注射液共10批，由雅安三九藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters XBridgeTM BEH Shie1d IP18色譜柱（4.6 mm×100 mm，2.5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～6 min，0%→10%A；6～8 min，10%→23%A；8～10 min，23%A；10～17 min，23%→60%A；17～19 min，60%→100% A）；體積流量2 mL/min；檢測波長203 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量4 μL。

2.2 參照物溶液的制備 精密稱取人參皂苷Ig1、Ie、Ib1適量，加20%乙腈制成每1 mL分別含0.10、0.08、0.20 mg樣品的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取參麥注射液適量，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.4 對(duì)照?qǐng)D譜的制備 取參麥注射液的法定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照?qǐng)D譜，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2.0版）”軟件，導(dǎo)出數(shù)據(jù)文件。Microsoft Office Exce12007軟件對(duì)導(dǎo)出數(shù)據(jù)文件中的保留時(shí)間除以5，保存，再導(dǎo)入相似度評(píng)價(jià)軟件，保存對(duì)照?qǐng)D譜，即得。結(jié)果見圖1。

圖1 參麥注射液的對(duì)照?qǐng)D譜Fig.1 Reference fingerprint of Shenmai Injection

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測定特征峰（16個(gè)）相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的ISD均小于2.5%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份，在“2.1”項(xiàng)條件下分別進(jìn)樣，測得其特征峰（16個(gè)）峰面積相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的ISD均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)

行測定，其特征峰（16個(gè)）峰面積相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的ISD均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 耐用性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下于另外2臺(tái)Agi1ent 1260高效液相色譜儀中進(jìn)樣，記錄色譜圖，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2.0版）”軟件計(jì)算相似度。結(jié)果，3個(gè)色譜圖的相似度（16個(gè)特征峰匹配）均為1.00，表明儀器耐用性良好。

2.6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 取10批參麥注射液供試品，分別在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖。同時(shí)，將其按參麥注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（標(biāo)準(zhǔn)號(hào)WS3-B-3428-98-2010Z）指紋圖譜的檢測方法進(jìn)行分析，“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2.0版）”軟件計(jì)算相似度，利用B1and-A1tman分析，對(duì)比兩種方法檢測結(jié)果的一致性，結(jié)果見表1和圖2。其中，± 2SD ofmean LSV的實(shí)線為±2倍法定方法所測10批指紋圖譜相似度的標(biāo)準(zhǔn)偏差（-0.01，＋0.01），視為方法一致性評(píng)價(jià)的可接受界限；±1.96SD的虛線為95%的一致性界限，即以法定方法與快速測定法檢測相似度的±1.96倍差值均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差，下同。

表1 兩種測定方法的相似度Tab.1 Sim ilarities of tWo determ ination methods

由圖可知，10組數(shù)據(jù)的差值均在B1and-A1tman分析的一致性界限范圍內(nèi)，但偏離了可接受界限。因此可認(rèn)為，快速測定法與法定標(biāo)準(zhǔn)法的相似度基本一致，但需要進(jìn)行一定修正，才能使評(píng)價(jià)結(jié)果更一致，并且偏差可被接受。造成一致性界限偏離可接受界限的原因據(jù)推測，可能是兩種方法檢測相似度的差值均數(shù)較高（0.013），故以0.013為相似度修正值，將快速檢測法的相似度＋0.013，再用B1and-A1tman分析，結(jié)果見圖3。由圖可知，修正后的一致性界限小于可接受界限，表明對(duì)該方法所測相似度進(jìn)行修正后，與法定標(biāo)準(zhǔn)法一致，并且偏差可被接受。

圖2 兩種測定方法相似度的Bland-A ltman分析Fig.2 Bland-Altman analysis of the sim ilarities of tWo determ ination methods

圖3 兩種測定方法相似度的修正Bland-Altman分析Fig.3 Revised Bland-A ltman analysis of the sim ilarities of tWo determ ination methods

取兩種方法指紋圖譜中16個(gè)特征峰的峰面積，利用夾角余弦相似度公式［11］，計(jì)算相同樣品不同方法所測指紋圖譜特征峰的匹配相似度，結(jié)果見表1。由表可知，兩種方法所測指紋圖譜特征峰面積的相似度較高，達(dá)到0.96以上，表明快速測定法對(duì)16個(gè)特征峰峰面積比例的影響不大。

然后，比較兩種檢測法的色譜圖，結(jié)果見圖4。由圖可知，快速檢測法與法定標(biāo)準(zhǔn)法所測指紋圖譜除保留時(shí)間發(fā)生較大變化外，其它色譜行為基本一致，即前者存在后者所測指紋圖譜中的16個(gè)特征峰，并且出峰順序一致，表明快速檢測法對(duì)參麥注射液色譜行為的影響較小。

圖4 兩種測定方法的指紋圖譜Fig.4 Fingerprints of tWo determ ination methods

3 討論

快速測定法采用Waters X-BridgeTM BEH Shie1d IP18色譜柱（4.6 mm×100 mm，2.5 μm），該色譜柱為Waters公司推出的小粒徑超高效液相色譜柱，硅膠顆粒通過亞乙基橋雜化。與硅膠基體的色譜填料顆粒相比，具有更寬的pH使用范圍（1～12），而且使色譜柱具有更低的次級(jí)相互作用，峰形更好，柱效更高［12］。色譜柱粒徑越小，塔板高度越低，柱效越高，并且減小填料的粒度也有利于發(fā)揮高流速的優(yōu)勢，可以在更寬的線速范圍內(nèi)使用［13］。該色譜柱以2 mL/min體積流量洗脫時(shí)，線速率約為2.00 mm/min，在2.5 μm粒徑色譜柱的最佳柱效線速度范圍內(nèi)［13］。

使用該色譜柱時(shí)，需要解決傳統(tǒng)的HPLC耐壓問題。G1311B Agi1ent 1260 Infinity能夠耐壓600 bar，但實(shí)際快速分析時(shí)，柱壓力最大只有380 bar，即其完全能滿足快速分析要求?？焖贉y定法指紋圖譜的分析時(shí)間為19 min，相對(duì)于法定標(biāo)準(zhǔn)法（95 min）縮短了80%，大幅提高了分析效率，并降低了樣品存放穩(wěn)定性的風(fēng)險(xiǎn)。

采用B1and-A1tman統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，能就兩種測量方法對(duì)同一樣本各測量一次的設(shè)計(jì)情形進(jìn)行一致性評(píng)價(jià)［14］。通過計(jì)算兩種方法結(jié)果之間的差異均數(shù)及其標(biāo)準(zhǔn)差，獲得LoA，再根據(jù)其是否在可接受的誤差范圍內(nèi)，用以判定兩種方法之間的一致性。目前，應(yīng)用B1and-A1tman一致限LoA，進(jìn)行方法對(duì)比研究的一致性評(píng)價(jià)得到普遍認(rèn)可［15］。利用B1and-A1tman統(tǒng)計(jì)法比較快速檢測法和法定標(biāo)準(zhǔn)法對(duì)參麥注射液相似度評(píng)價(jià)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)前者可用于指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)，并且結(jié)果與后者一致。

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Rapid determ ination of Shenmai Injection fingerprint by HPLC

DONG Li， GAN Jian-wei， LIMei， WU Jian-guo
（Ya＇an SanJiu Pharmaceutical Co.，Ltd.，Ya＇an 625OOO，China）

ABSTRACT：AIM To estab1ish an HPLC method for rapid1y determining Shenmai Injection（red ginseng and Ophiopogon Japonicas）fingerprint.METH 0DS The ana1ysis was performed on a Waters X-BridgeTM BEH Shie1d IP18 co1umn（4.6 mm×100 mm，2.5 μm），mobi1e phase was acetonitri1e-water with gradient e1ution，f1ow rate was 2.0 mL/min，detection wave1ength was set at203 nm，co1umn temperaturewasmaintained at30℃，and injection vo1ume was 4 μL.Then ten batches of Shenmai Injection were detected，and the resu1ts ana1yzed bybook=600,ebook=134rapid determination and 1ega1standard were compared.RESULTS The simi1arities of rapid determination and 1ega1standard were basica11y identica1.C0NCLUSI0 N Thismethod is rapid，accurate and stab1e，which can rep1ace the detection method of fingerprint in 1ega1standard.

作者簡介：董 禮（1983—），男，碩士，助理研究員，從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。Te1：（0835）2228091，E-mai1：gsnhd1@hotmai1.com

基金項(xiàng)目：國家重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng)（2009ZX09502-030）

收稿日期：2015-05-12

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.026

中圖分類號(hào)：I284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1528（2016）03-0599-04