杜金鼎 高鳳云 李 文

(山東魯抗生物制造有限公司,山東濟(jì)寧 273500)

發(fā)酵液中的L-色氨酸分離純化研究

杜金鼎 高鳳云 李 文

(山東魯抗生物制造有限公司,山東濟(jì)寧 273500)

L-色氨酸在天然蛋白質(zhì)內(nèi)含量比較豐富,是人與動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育所必需氨基酸之一,并且隨著其效用的研究發(fā)現(xiàn),現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用到食品、醫(yī)藥與飼料等多個(gè)方面。本文結(jié)合發(fā)酵液中L-色氨酸分離純化試驗(yàn)對(duì)工藝要點(diǎn)進(jìn)行了簡(jiǎn)要分析。

發(fā)酵液;L-色氨酸;分離純化

經(jīng)過(guò)分離純化在發(fā)酵液內(nèi)獲得L-色氨酸是現(xiàn)在比較新型的而一種生產(chǎn)方法，包括離子交換法、結(jié)晶法等，在實(shí)際作業(yè)中具有工藝簡(jiǎn)單、污染小、能耗低以及成本低等優(yōu)點(diǎn)。為提高L-色氨酸收率，需要總結(jié)以往生產(chǎn)工藝，對(duì)分離純化過(guò)程進(jìn)行分析，確定影響因素，然后采取措施來(lái)做更進(jìn)一步的優(yōu)化，提高產(chǎn)品提取率。

1 L-色氨酸特點(diǎn)分析

L-色氨酸即L-氨基-吲哚基丙酸，分子式為C11H12O12N2，呈白色或略帶黃色葉片狀結(jié)晶或粉末，無(wú)臭或微臭，微溶于乙醇。其在堿液內(nèi)穩(wěn)定性比較高，但是遇到其他氨基酸或糖類(lèi)則容易分解。L-色氨酸作為人與生物生命活動(dòng)必需氨基酸之一，對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育和新陳代謝具有重要作用。并且還可以將其應(yīng)用到醫(yī)藥方面，例如氨基酸輸液、調(diào)節(jié)腦代謝等。L-色氨酸同時(shí)也是部分植物蛋白所缺乏氨基酸種類(lèi)之一，利用其對(duì)來(lái)制作食品或飼料添加劑，對(duì)提高植物蛋白利用率具有重要意義，現(xiàn)在已經(jīng)成為蛋氨酸與賴(lài)氨酸之后又一飼料添加氨基酸。L-色氨酸基于其性能特點(diǎn)，現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛的用于多個(gè)領(lǐng)域，為進(jìn)一步提高產(chǎn)品收率，需要就現(xiàn)有生產(chǎn)工藝進(jìn)行分析，采取措施對(duì)所存不足進(jìn)行優(yōu)化，控制成本的同時(shí)，提高生產(chǎn)效率。

2 L-色氨酸生產(chǎn)技術(shù)

2.1 化學(xué)合成法

應(yīng)用化學(xué)合成法生產(chǎn)L-色氨酸，常用原料主要包括苯肼和吲哚兩種，反應(yīng)后得到DL消旋體色氨酸，通過(guò)進(jìn)一步光學(xué)導(dǎo)構(gòu)體拆分，便可得到生物可以利用的L-色氨酸[2]。此種方法在實(shí)際操作上工藝要求比較嚴(yán)格，且受原材料限制大，在很大程度上遏制了其在工業(yè)領(lǐng)域的發(fā)展應(yīng)用。

2.2 蛋白質(zhì)水解法

蛋白質(zhì)水解法生產(chǎn)L-色氨酸，需要將血粉、毛發(fā)與廢蠶絲等富含L-色氨酸的物料作為原料，經(jīng)過(guò)堿水解法或者酶水解法處理，水解反應(yīng)生成L-色氨酸。此種方法在實(shí)際應(yīng)用中具有周期長(zhǎng)、工藝復(fù)雜以及產(chǎn)品復(fù)雜等特點(diǎn)，并且原料來(lái)源限制大，生產(chǎn)所得L-色氨酸數(shù)量有限，并不適合工業(yè)生產(chǎn)。

2.3 微生物法

即前體發(fā)酵法，將葡萄糖作為碳源，加入鄰氨基苯甲酸、吲哚、L-絲氨酸等前體物，通過(guò)微生物色氨酸合成酶系轉(zhuǎn)化前體生成得到L-色氨酸。為保證產(chǎn)物質(zhì)量，反應(yīng)時(shí)需要控制前體物所加數(shù)量，避免添加量過(guò)多抑制微生物的生長(zhǎng)，可以選擇用分批少量或流加方法。雖然得率比較高，但是因?yàn)槭辗答佌{(diào)節(jié)抑制比較大，前體物成本較高，所需投資比較大。其中，利用微生物體內(nèi)L-色氨酸生物合成酶系催化生產(chǎn)L-色氨酸即酶法，生產(chǎn)所得產(chǎn)品純度高、濃度高、生產(chǎn)周期短、副產(chǎn)物少并且易于分離純化，是工業(yè)生產(chǎn)L-色氨酸最為常見(jiàn)的一種方法。

3 發(fā)酵液內(nèi)L-色氨酸分離純化試驗(yàn)分析

3.1 材料設(shè)備

材料：L-色氨酸基因工程菌接種于M63培養(yǎng)基發(fā)酵得到發(fā)酵液；離子交換樹(shù)脂；L-色氨酸則為日本進(jìn)口分裝，其他試劑均為分析純?cè)噭?/p>

設(shè)備：RF-5301型熒光分光光度計(jì)、LKB2132蠕動(dòng)泵、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)、恒溫振蕩器以及氨基酸自動(dòng)分析儀。

3.2 工藝方法

3.2.1 材料預(yù)處理

對(duì)樹(shù)脂和發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，其中發(fā)酵液可以利用高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，按照10000r·min-1離心處理20min，將發(fā)酵液內(nèi)含有的菌體與蛋白質(zhì)等雜質(zhì)全部清除干凈。

3.2.2 靜態(tài)實(shí)驗(yàn)

（1）吸附實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取一定量預(yù)處理的樹(shù)脂置于100ml具塞三角瓶?jī)?nèi)，加入適量L-色氨酸溶液，以100r·min-1與室溫條件下在搖床上振蕩，結(jié)束后取樣分析，溶液內(nèi)L-色氨酸濃度不變時(shí)為吸附平衡。計(jì)算樹(shù)脂對(duì)L-色氨酸平衡吸附量：Q=（C0-C）×V/W，其中C0表示吸附前溶液中L-色氨酸質(zhì)量濃度，單位g·L-1；C表示吸附后溶液內(nèi)L-色氨酸質(zhì)量濃度，單位g·L-1；V表示溶液體積，單位L；W表示濕樹(shù)脂質(zhì)量，單位g。

（2）洗脫實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取適量吸附平衡后樹(shù)脂置于100ml具塞三角瓶?jī)?nèi)，然后接入適量洗脫液，放置搖床上以100r·min-1與室溫條件下振蕩，結(jié)束后取樣閥內(nèi)洗，當(dāng)溶液內(nèi)L-色氨酸濃度不變時(shí)為洗脫平衡。

3.2.3 動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)

（1）吸附實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取6g濕樹(shù)脂置于離子交換柱內(nèi)，以6g·L-1的L-色氨酸溶液上柱，分別以0.5、1、2ml·min-1流速吸附。當(dāng)柱底流出液與上柱液濃度相同時(shí)停止上柱，對(duì)流出液進(jìn)行分部收集測(cè)定，確定最佳吸附流速。

（2）洗脫實(shí)驗(yàn)

選擇0.5、1、2mol·min-1的氨水，對(duì)吸附飽和樹(shù)脂進(jìn)行洗脫，按照0.5、1、2ml·min-1洗脫速度處理，并對(duì)流出液進(jìn)行分部收集測(cè)定，確定最佳氨水濃度與洗脫速度。

3.3 過(guò)程分析

3.3.1 流速

選擇6g濕樹(shù)脂放于離子交換柱內(nèi)，L-色氨酸溶液濃度為6g·L-1，以不同流速泵入離子交換柱，直到柱底流出液與上柱液濃度相同時(shí)停止上柱。根據(jù)結(jié)果分析，可以確定隨著進(jìn)料流速的增加，飽和吸附容量持續(xù)降低，但是為避免流速過(guò)慢造成吸附周期延長(zhǎng)，應(yīng)將進(jìn)料速度控制在1ml·min-1。

3.3.2 洗脫速度

選擇2mol·L-1氨水作為洗脫劑，按照0.5、1和2mol·L-1洗脫速度對(duì)吸附飽和樹(shù)脂進(jìn)行洗脫。試驗(yàn)結(jié)果證明隨著洗脫速度的減低，洗脫效果越好。但是洗脫速度也不得過(guò)慢，避免延長(zhǎng)洗脫周期，導(dǎo)致結(jié)柱現(xiàn)象嚴(yán)重，最佳洗脫速度應(yīng)控制在0.5ml·min-1即可。

4 結(jié)束語(yǔ)

L-色氨酸對(duì)人和動(dòng)物生命活動(dòng)具有重要意義，為提高其收率，需要加深對(duì)發(fā)酵液分離純化工藝的研究，掌握各項(xiàng)影響因素，對(duì)工藝過(guò)程進(jìn)行有效控制，提高生產(chǎn)效率。

[1] 賀希娜.發(fā)酵液中L-色氨酸的分離純化研究[D].福建師范大學(xué)，2013.

[2] 蘇毅.發(fā)酵法生產(chǎn)L-色氨酸工藝優(yōu)化[D].天津科技大學(xué)，2014.