趙化芳

(新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)畜牧獸醫(yī)工作總站，新疆烏魯木齊 830063)

淺談微生物濁度法在測(cè)定硫酸鏈霉素中的影響因素

趙化芳

(新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)畜牧獸醫(yī)工作總站，新疆烏魯木齊 830063)

濁度法是在比色皿中按拉丁方排列，加入高低含量的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液1ml，再加入含葡萄球菌的液體培養(yǎng)基9ml，通過(guò)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品和硫酸鏈霉素的吸光度，計(jì)算樣品含量。現(xiàn)將試驗(yàn)過(guò)程中的環(huán)境、儀器設(shè)備、菌種、培養(yǎng)基、緩沖液、抗生素配置和參數(shù)設(shè)置等影響因素淺談如下。

濁度法；硫酸鏈霉素；影響因素

1 環(huán)境和儀器設(shè)備的影響

半無(wú)菌室環(huán)境，室內(nèi)照明充足，最好有溫度控制設(shè)備，并安裝紫外線消毒燈，操作臺(tái)高低要合適。WBS-100微生物比濁法測(cè)定儀配備傳熱均勻的專用試管，減少因試管壁傳熱不均造成的光路長(zhǎng)度不均的影響；具有升溫快速均勻，溫度精密度高，入射光波長(zhǎng)精度高，振搖培養(yǎng)，在線實(shí)時(shí)檢測(cè)等功能。實(shí)驗(yàn)環(huán)境和儀器設(shè)備是保障試驗(yàn)成功的前提條件。

2 菌種選擇和菌濃度的影響

2.1 菌種的選擇

實(shí)驗(yàn)用菌種應(yīng)保持新鮮、純凈，對(duì)抗生素反應(yīng)應(yīng)靈敏。若菌種不新鮮，其生長(zhǎng)速度慢，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)濁度達(dá)不到要求；若菌種不純，各管形成的吸收度精密度差，可信限率高；若菌種對(duì)抗生素反應(yīng)不靈敏，高低劑量抗生素形成的吸收度距離減小，測(cè)定結(jié)果可信限率顯著增高。本實(shí)驗(yàn)選用對(duì)鏈霉素反應(yīng)靈敏的金黃色葡萄球菌的第三代培養(yǎng)菌，接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，用7ml滅菌水將菌苔洗下制成菌懸液，當(dāng)天使用。

2.2 菌濃度的要求

菌液濃度過(guò)高會(huì)使?jié)舛?光吸收度不成直線關(guān)系，如果菌液濃度過(guò)稀，則讀數(shù)偏低，誤差增大，在實(shí)際測(cè)定時(shí)一般可控制吸收度讀數(shù)在0.3～0.7A較為適宜[1]。

3 培養(yǎng)基pH值和性質(zhì)的影響

采用液體培養(yǎng)基，無(wú)擴(kuò)散因素的影響，實(shí)驗(yàn)的靈敏度高，結(jié)果的精密度和正確率高。硫酸鏈霉素屬于堿性抗生素，抗生素檢定培養(yǎng)基3號(hào)，pH為7.0～7.2，含有牛肉膏、酵母提取物，葡萄糖和磷酸鹽等促進(jìn)細(xì)菌快速生長(zhǎng)的條件。稱取抗生素檢定培養(yǎng)基3號(hào)19.0g加入1000ml蒸餾水中，加熱煮沸完全溶解后分裝，116℃高壓滅菌30min，滅菌時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，滅菌后不得發(fā)生沉淀，影響培養(yǎng)基性能。

4 緩沖液的影響

稱取磷酸氫二鉀5.59g，磷酸二氫鉀0.41g，加水定容至1000ml容量瓶，配制pH值為7.8的緩沖液[1]。分裝于硬質(zhì)玻璃容器內(nèi)，應(yīng)澄明無(wú)色，必要時(shí)用耐酸過(guò)濾漏斗濾除沉淀，121℃高壓滅菌30min后不得有沉淀，影響透光度。

5 抗生素溶液配置和加入的影響

分別精密稱取鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)和注射用硫酸鏈霉素適量于容量瓶中，加入適量滅菌水使標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶解完全，定容制成含1000U/ml的溶液；根據(jù)試驗(yàn)菌的靈敏度選擇溶液的劑間比為1：1.5，劑間比過(guò)大將導(dǎo)致高低劑量間濁度值距離過(guò)大，劑間比過(guò)小則相反；根據(jù)抗生素濃度濃度范圍，加入pH7.8滅菌緩沖液配置標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液的最終濃度為6 U/ml和9 U/ml。抗生素濃度過(guò)高過(guò)低均不能得到正確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

按拉丁方排列加入上述溶液，以抵消培養(yǎng)箱內(nèi)溫度的差異所引入的誤差。分別在某一標(biāo)記處沿壁將高低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液各1ml加入到比色皿中，在標(biāo)記稍上處沿壁加入含菌培養(yǎng)基9ml，將沾在壁上的抗生素充分洗入培養(yǎng)基內(nèi)，減少濃度誤差。同時(shí)制備含菌陽(yáng)性對(duì)照管和無(wú)菌培養(yǎng)基空白對(duì)照管。整個(gè)過(guò)程在短時(shí)間內(nèi)完成，減少抗生素與含菌培養(yǎng)基接觸時(shí)間不同造成的誤差。

6 培養(yǎng)條件設(shè)置的影響

將加入試劑的石英比色皿放入WBS-100微生物比濁法測(cè)定儀中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置實(shí)驗(yàn)參數(shù)：培養(yǎng)溫度為37℃，振搖間隔時(shí)間為5min，單次振搖時(shí)間為20s，振搖頻率為2HZ，監(jiān)測(cè)間隔時(shí)間為10min，監(jiān)測(cè)開始時(shí)間為45min停止時(shí)間為240min。

培養(yǎng)基的頂端部分為微親氧性，底部為厭氧性，采用間隔一段時(shí)間振搖一次的方法，增加氧的供應(yīng)，促進(jìn)生長(zhǎng)，縮短培養(yǎng)時(shí)間，但設(shè)置合理的振幅和振搖頻率，避免振搖過(guò)程中產(chǎn)生氣泡干擾試驗(yàn)結(jié)果；實(shí)時(shí)監(jiān)控生長(zhǎng)情況，智能判斷培養(yǎng)終止時(shí)間，在線快速讀數(shù)，有效減小了因測(cè)量時(shí)間先后導(dǎo)致的濁度值差異。

經(jīng)統(tǒng)計(jì)，通過(guò)濁度法測(cè)定效價(jià)平行性好，精密度高、可信限率低至3以下，偏離平行符合規(guī)定，滿足實(shí)驗(yàn)需要。

7 防止污染

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)防抗生素、微生物、灰塵和毛發(fā)等污染，試驗(yàn)用比色皿、吸管等應(yīng)用硫酸-重鉻酸鉀浸泡12h以上，再用蒸餾水和去離子水沖洗干凈，經(jīng)高壓滅菌后使用，嚴(yán)防抗生素殘留和微生物污染。另外在培養(yǎng)基、緩沖液，抗生素配置過(guò)程中嚴(yán)防空氣中灰塵和自制棉賽毛發(fā)污染，影響澄明度和濁度值。

8 小結(jié)

濁度法具有靈敏度高，精密度高，測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確、可信限率低、時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，3～4h內(nèi)完成監(jiān)測(cè)，當(dāng)天獲得試驗(yàn)結(jié)果。但濁度法要求高，消除環(huán)境設(shè)施、儀器設(shè)備、試劑材料和參數(shù)設(shè)置等不利影響因素，防止抗生素、微生物和灰塵毛發(fā)等污染。

[1] 中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典[S].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2010：附錄，121-128.

[2] 彭素梅，李洪波.濁度法測(cè)定四環(huán)素效價(jià)的可行性研究[J].中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2010，4（14）：131-132.

[3] 丁勃，楊娜，謝元超.比濁法測(cè)定抗生素效價(jià)中常見(jiàn)問(wèn)題及分析[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2010，11（6）：438-440.

趙化芳（1987—），女，大學(xué)本科，助理獸醫(yī)師，從事畜牧獸醫(yī)和實(shí)驗(yàn)室相關(guān)檢測(cè)工作。