蔡洪敏　王業(yè)勝　許國(guó)鳳　李黃金　趙　林（廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院　廣州510006）

?

腹水型抗EGF R單克隆抗體純化方法的研究△

蔡洪敏王業(yè)勝許國(guó)鳳李黃金趙林*（廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院廣州510006）

摘要：目的：研究腹水型抗EGFR單克隆抗體的純化方法。方法：抗EGFR雜交瘤細(xì)胞誘生的腹水，經(jīng)離心預(yù)處理，上清先用PEG6000沉淀，沉淀物溶解再用Protein-A柱親和純化，SDS-PAGE鑒定純化效果。結(jié)果：經(jīng)兩步純化，抗EGFR單抗純度達(dá)到了98%以上，收率達(dá)到90%以上。結(jié)論：PEG6000沉淀和Protein-A柱親和層析相結(jié)合，是純化腹水型單抗體的一種高效方法。

關(guān)鍵詞：腹水EGFR單克隆抗體純化

表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermical growth factor receptor，簡(jiǎn)稱為EGFR）是當(dāng)前腫瘤治療的熱門靶點(diǎn)，采用單克隆抗體封閉EGFR信號(hào)通路，以抑制EGFR過(guò)表達(dá)或突變的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，是治療EGFR相關(guān)腫瘤的一種主要策略[1]。我們?cè)谇捌谘芯恐校l(fā)現(xiàn)了EGFR二聚化界面的一個(gè)腫瘤B細(xì)胞表位肽[2]，針對(duì)該表位制備了特異性的抗EGFR單克隆抗體。為詳細(xì)研究該單抗的功能，本文研究其純化方法。

1　材料與方法

1.1材料與試劑：抗EGFR小鼠腹水由本實(shí)驗(yàn)室制備，-20℃凍存?zhèn)溆?；PEG6000：上海翊圣生物公司；Protein-A親和層析預(yù)裝柱（5mL）：北京康為世紀(jì)公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒：北京鼎國(guó)昌盛公司；低分子量蛋白Marker：大連寶生物公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1腹水預(yù)處理：將-20℃凍存的抗EGFR腹水于4℃解凍過(guò)夜，4℃，10000×g離心15min，吸棄表層油脂，上清于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2采用PEG6000進(jìn)行粗分離：取上清置于冰上，加入等體積預(yù)冷的20mM磷酸鹽緩沖液，攪拌均勻。邊攪拌邊緩慢加入預(yù)冷的濃度為30%的PEG6000溶液，至終濃度為10%。冰上放置1h后，8000rpm離心20min，棄上清，收集沉淀。沉淀用適量含300mM NaCl，pH8.0，20mM磷酸鹽緩沖液溶解成蛋白濃度約為1mg/mL的溶液。

1.2.3采用Protein-A柱進(jìn)行精細(xì)純化：Protein-A柱用含300mM NaCl，pH8.0的20mM磷酸鹽緩沖液流洗5～10個(gè)柱床體積，以平衡柱子。將上一步溶解的樣品上柱，速度控制在2mL/min。以平衡緩沖液沖洗柱子5～10個(gè)柱床體積，至基線平穩(wěn)。用pH4.0 的0.1M檸檬酸鈉緩沖液洗脫，收集洗脫峰樣品，用pH9.0的1M Tris-HCl中和緩沖液將洗脫峰樣品中和至中性。用5～10個(gè)柱床體積平衡緩沖液平衡柱子至中性。

1.2.4樣品濃度及純度測(cè)定：用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒分別測(cè)定腹水、PEG6000粗分離產(chǎn)物、Protein-A柱精細(xì)純化產(chǎn)物的濃度，用SDS-PAGE分析各樣品中抗EGFR單抗的純度。

2　結(jié)果與分析

2.1純化結(jié)果：預(yù)處理后的腹水樣品經(jīng)PEG6000沉淀后，單抗被選擇性沉淀下來(lái)，在上清中幾乎沒有殘留，同時(shí)白蛋白等主要雜蛋白被留在上清中，PEG6000很好地實(shí)現(xiàn)了粗分離，如圖1所示。經(jīng)凝膠掃描軟件分析，粗分離后單抗的純度達(dá)到85%以上。粗分離的單抗經(jīng)Protein-A柱純化后，洗脫峰樣品中幾乎無(wú)雜質(zhì)，經(jīng)凝膠掃描軟件分析，純度達(dá)到98%以上，如圖2所示。

2.2純化收率和純度：經(jīng)凝膠掃描分析軟件分析，PEG6000粗分離樣品的純度達(dá)到85.6%，Protein-A柱精細(xì)純化后，抗體的樣品純度達(dá)到98%以上。PEG6000沉淀分離后，目標(biāo)產(chǎn)物的收率達(dá)到91%，Protein-A柱親和層析后，收率達(dá)到89%，兩步純化的總收率達(dá)到80.99%，收率較高。

3　討論

單抗的純化是進(jìn)行抗體功能研究的前一步。在目前的純化方法中，有鹽析法、親和純化法、透析法，純度往往達(dá)不到應(yīng)用要求[3，4]。在本研究中，PEG6000具有很好的沉淀選擇性，10%的PEG6000很好地沉淀了單抗而將大量的主要雜蛋白即白蛋白留在上清中。這一步的純化為后一步Protein-A柱的親和層析，減輕了上樣負(fù)擔(dān)，增加了純化的效率。本研究的兩步純化法純化單抗，既有高的純度又有高的回收率，是純化單抗一種行之有效的方法。

參考文獻(xiàn)

[1]Roskoski RJ.The ErbB/HER family of protein-tyrosine kinases and cancer[J].Pharmacological Research.2013，79C：34-74.

[2]Zhu L，Zhao L，Wu M，Chen Z，Li H.B-cell epitope peptide vaccination targeting dimer interface of epidermal growth factor receptor（EGFR）[J].Immunol Lett.2013，153（1-2）：33-40.

[3]肖增鴻，黃昭亮，林月霞，等.腹水型單克隆抗體純化方法的研究[J].中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)，2013，8（6）：425-428.

[4]周玉，李巖松，潘風(fēng)光，等.小鼠腹水IgG類單克隆抗體純化方法的研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2006，10：14-16.

△項(xiàng)目來(lái)源：廣東藥學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（1057313025）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014A020210027）；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015A030310120）。

*通訊作者

中圖分類號(hào)：R73

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1672-8351（2016）01-0098-01