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一點(diǎn)紅中總生物堿的提取與測(cè)定方法研究

陳燕婷黃銳濤陳光孝紀(jì)敏琳胡文海姜濤*（吉林大學(xué)珠海學(xué)院珠海519041）

摘要：目的：探討超聲波法和索式提取法對(duì)一點(diǎn)紅中總生物堿的最佳工藝條件與測(cè)定方法的研究。方法：以紫外分光光度法為測(cè)定方法，一點(diǎn)紅中總生物堿提取來量為考察目標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化提取工藝。結(jié)果：不同溫度、不同濃度、提取時(shí)間對(duì)一點(diǎn)紅總生物堿提取量有顯著影響。提取次數(shù)影響不大。結(jié)論：超聲波法的提取最佳工藝為80℃下以物料比為1∶40對(duì)一點(diǎn)紅生物堿類物質(zhì)進(jìn)行30min提取，得出提取率為0.435%，索式提取法的提取最佳工藝為用80%的乙醇對(duì)一點(diǎn)紅生物堿類物質(zhì)進(jìn)行2h提取，得出提取率為0.320%。通過兩種方法的比較，一點(diǎn)紅總生物堿的提取為超聲波法更優(yōu)。

關(guān)鍵詞：一點(diǎn)紅生物堿超聲波法索式提取法正交設(shè)計(jì)

一點(diǎn)紅Emilia sonehifolia DC．，又名羊蹄草、紅背葉、葉下紅、紅背果等，菊科一點(diǎn)紅屬一年生或多年生草本，分布于我國(guó)華南、華中和西南等地。一點(diǎn)紅性味涼，具有清熱解毒、活血散淤之功，臨床上常用于治療上呼吸道感染、口腔潰瘍、肺炎、乳腺炎、癤腫瘡瘍、皮膚濕疹等[1，2]。已報(bào)道該植物地上部分含有吡咯雙烷類生物堿和黃酮類化合物，還含有植物甾醇、脂肪酸等化學(xué)成分[3]。由于化學(xué)活性尚未明確，故需通過不同方法測(cè)定一點(diǎn)紅總生物堿含量從而控制原材藥的質(zhì)量。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器：紫外可見分光光度計(jì)（日本島津）；超聲波發(fā)聲儀（AS7240ADT）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀）；索式提取器（上海BOMEX-250）；電加熱套（DHT型攪拌調(diào)溫電熱套）。苦參堿對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；乙醇；氯仿等試劑均為分析純。

1.2波長(zhǎng)的選擇：分別取苦參堿對(duì)照品液、一點(diǎn)紅總生物堿樣品液適量，加入溴麝香草酚藍(lán)顯色劑10mL，密塞，劇烈振搖2min提取，靜置2h，分取氯仿層。以未加樣液的氯仿顯色層作為參比在400～800nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果苦參堿對(duì)照品液和一點(diǎn)紅樣品液均在414nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故測(cè)定時(shí)選用此波長(zhǎng)。

1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取苦參堿對(duì)照品4.2mg，加入氯仿定容至100mL，即得溶液濃度為42μg/mL苦參堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確稱取溴麝香草酚藍(lán)31.25mg，置250mL量瓶中，加配置好的pH=7.6磷酸二氫鉀緩沖溶液至刻度，搖勻即得。然后取7個(gè)10mL的容量瓶，分別用移液槍精密吸取苦參堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于容量瓶中，加入氯仿至刻度，搖勻顯色；以第一管未加苦參堿的氯仿層作空白對(duì)照，在414nm處測(cè)各苦參堿對(duì)照品的吸光度值。以苦參堿對(duì)照品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y= 0.0416x+0.0014，R2=0.9977。

1.4索氏提取法提取生物堿的含量測(cè)定：稱取4份同批一點(diǎn)紅藥粉各5g于4個(gè)索式提取器中，分別加入60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇各100mL進(jìn)行水浴回流（提取2次，每次提取1h），合并提取液；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，揮干溶劑得到生物堿粗提取物浸膏[4，8]。浸膏加水熱熔并加2%鹽酸溶解，調(diào)節(jié)ph值為2～3，減壓抽濾；濾液用氯仿萃取至氯仿層無色，棄去氯仿層，水層用10%氨水調(diào)節(jié)pH值為9～11，用氯仿萃取，精密吸取續(xù)濾液1mL至10mL容量瓶中，加氯仿至刻度[5]。最后精取10mL樣液至分液漏斗，加入溴麝香草酚藍(lán)顯色劑20mL，密塞，劇烈振搖2min，然后靜置2h后分取氯仿層，備用。

1.5超聲波法提取生物堿的含量測(cè)定：按正交實(shí)驗(yàn)法[6]對(duì)超聲提取法提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)選，分別對(duì)不同溫度40℃、60℃、80℃，不同時(shí)間20min、30min、40min，不同物料比1∶30、1∶40、1∶50進(jìn)行優(yōu)化條件的選擇。其具體方法是分別取一點(diǎn)紅全草粗粉1g，置具塞錐形瓶中，加濃氨水4滴，精密加入氯仿40mL，然后置于超聲波容器內(nèi)，按不同的條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，待溶液冷卻后補(bǔ)足失重，濾過，精密吸取續(xù)濾液1mL用氯仿定容至10mL備用。精取10mL樣液至分液漏斗，加入溴麝香草酚藍(lán)顯色劑20mL，密塞，劇烈振搖2min，然后靜置2h后分取氯仿層，備用[7]。

1．6方法學(xué)考察

1．6．1精密度結(jié)果試驗(yàn)分析：對(duì)苦參堿標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為42μg/ mL）進(jìn)行5次平行測(cè)定，測(cè)得5個(gè)吸光度值，計(jì)算RSD值為0.97%，結(jié)果顯示精密度良好。見表1。

表1　苦參堿標(biāo)準(zhǔn)溶液精密度試驗(yàn)Table 1matrine standard solution precision test

1．6．2樣品的重復(fù)性考察：取同一批樣品，分別采用超聲波選擇條件為30min，80℃，料液比為1∶40；索式提取法選擇條件為80%乙醇提取，時(shí)間為2h進(jìn)行3次平行測(cè)定。結(jié)果表明無論是索式提取法或超聲波法，重復(fù)性均很好，RSD<1%。見表2。

表2　超聲波法和索式提取法提取一點(diǎn)紅中總生物堿含量的重復(fù)性測(cè)定Table 2 repetitive determination of the total alkaloid content usingultrasonic extraction and soxhlet extraction in Emilia Sonehifolia

1．6．3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)考察：取供試品溶液顯色后于0，30min，60min，90min，120min，150min，180min進(jìn)行吸光度測(cè)定。測(cè)定結(jié)果如下表所示，并計(jì)算得到RSD為0.38%（n=7）。結(jié)果顯示樣品溶液顯色后在120min內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定。見表3。

表3　苦參堿標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 3matrine standard solution stability test

1．6．4加樣回收試驗(yàn)：取同一批已知含量的一點(diǎn)紅全草粗粉6份，分別精密加入苦參堿對(duì)照品液適量，混勻蒸干，按照樣品測(cè)定項(xiàng)下操作，測(cè)定含量，結(jié)果平均加樣回收率為93.55%，RSD＝3.459%（n＝6）。結(jié)果見表3。其中回收率=（測(cè)得量-樣品中含有的量）/加入對(duì)照品的量*100%。

表4　加樣回收率試驗(yàn)Table 4 sample recovery rate test

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1生物堿含量和提取率計(jì)算：將各待測(cè)液測(cè)得的吸光度值代入上述回歸方程，計(jì)算出各待測(cè)液濃度，該濃度值即為生物堿含量，再根據(jù)稀釋倍數(shù)換算出一點(diǎn)紅提取物總生物堿含量，并得出其提取率。

一點(diǎn)紅總生物堿含量（mg/g）=（C供×D×V）/m

式中，C供為供試品濃度，D為稀釋濃度，V為樣品定容體積，m為樣品取樣重量。

2.2不同條件下索氏提取法測(cè)樣品含量的結(jié)果及討論：取“1.2”中的備用待測(cè)液2mL用氯仿定容至10mL，以未加待測(cè)液的氯仿做空白，在414nm處測(cè)吸光度，每組重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)算平均值，結(jié)果如下：

表5　索式提取法中不同濃度乙醇的結(jié)果對(duì)比Table 5 The result of different comparing concentration of ethanol by Soxhlet extraction

由表5中得知，索式提取法中最優(yōu)提取工藝應(yīng)為用80%乙醇為提取溶劑對(duì)一點(diǎn)紅生物堿類進(jìn)行提取。

2.3超聲波法對(duì)樣品含量的測(cè)定結(jié)果及討論：取“1.3”中各組備用待測(cè)液2mL，分別用氯仿定容至10mL，以未加待測(cè)液的氯仿做空白，在414nm處測(cè)吸光度，每組重復(fù)測(cè)三次結(jié)果求平均值，結(jié)果如下：

表6　超聲波法不同條件結(jié)果對(duì)比Table 6 The result of different conditions by ultrasonic extraction

由上表得：在A、B、C三個(gè)因素中，A因素中，因?yàn)镵2＞K3＞K1，所以A因素中最佳的條件為超聲時(shí)間為30min，而B因素中，因?yàn)镵3＞K2＞K1，所以B因素中最佳的條件為溫度為80℃，在C因素下，因?yàn)镵1＞K2＞K3，所以C因素中最佳條件為料液比為1∶40g/mL。綜合以上因素，超聲波提取最佳條件為30min，80℃，料液比為1∶40。

3　結(jié)　論

通過本實(shí)驗(yàn)可知超聲波法優(yōu)于索式提取法。索式提取法耗時(shí)長(zhǎng)，藥品浪費(fèi)較嚴(yán)重且提取含量較低。實(shí)驗(yàn)采用超聲提取技術(shù)，不僅具有能耗低、效率高、不破壞有效成分的特點(diǎn)，利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、高加速度、空化效應(yīng)、攪拌作用等，加速植物材料中的有效成分進(jìn)入溶劑，從而增加有效成分的提取率，縮短提取時(shí)間，而且避免回流提取中高溫對(duì)提取成分的影響。

參考文獻(xiàn)

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[4]周吳萍，韋媛媛，李軍生，等.不同產(chǎn)地一點(diǎn)紅總生物堿的提取與分析[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19（7）：1593.

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致謝：感謝廣東省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：201413684014）及吉林大學(xué)珠海學(xué)院第八批百人工程項(xiàng)目對(duì)本實(shí)驗(yàn)提供資金贊助，也感謝吉林大學(xué)珠海學(xué)院所有指導(dǎo)和支持的老師們。

Extraction and Determ ination of Total Alkaloid about Em ilia Sonehifolia

Chen Yanting Huang Ruitao Chen Guangxiao Ji Minlin Hu Wenhai Jiang Tao*（Department of chemistry and pharmacy，ZhuHai College of JiLin University，ZhuHai，GuangDong，519041）

Abstract：Objective:discussing the optimum extraction conditions and determinationmethod of total alkaloid in Emilia Sonehifolia using themethod of ultrasonic extraction and soxhletextraction.Methods:use themethod of UV spectrophotometry to detect the contentof total alkaloid,to optimize the extraction process by orthogonal experimentmethod.Results:extraction quantity of total alkaloid has significant effect in the different temperature,ethanol concentration and extracting time.Conclusion:the best process of extraction was using 1:40 of material ratio for 30min under the 80℃in ultrasonic method，and extraction rate was 0.435%.the best process of extraction in soxhlet? extraction as follows:the duration of extraction was 2h with 80%ethanol，and extraction rate was 0.320%.Through the comparison of twomethods，we concluded that the bestmethod of extraction of total alkaloids in Emilia sonehifolia is ultrasonicmethod.

Key words:Emilia sonehifolia Alkaloid Ultrasonicmethod Soxhletextraction Orthogonal design

*通訊作者

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1672-8351（2016）01-0085-02