樂正永　聶明華　曾芳俐　李　敏（遵義市食品藥品檢驗(yàn)所　遵義563000）

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HPLC法測定復(fù)方首烏地黃丸中二苯乙烯苷的含量

樂正永聶明華曾芳俐李敏（遵義市食品藥品檢驗(yàn)所遵義563000）

摘要：目的：建立高效液相色譜法測定復(fù)方首烏地黃丸中制何首烏的2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-0-/3-D-葡萄糖苷（簡稱二苯乙烯苷）的含量。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱為WIech UItimateRXB－C1（8250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈-水（18∶82），檢測波長為320nm，流速為1.0mL·min－1。結(jié)果：二苯乙烯苷在0.052～1.05μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R=0.9999）。平均回收率為99.42%（RSD=0.52%n=6）。結(jié)論：此方法簡單，快速，重現(xiàn)性好，可作為復(fù)方首烏地黃丸的質(zhì)量控制方法。

關(guān)鍵詞：復(fù)方首烏地黃丸制何首烏二苯乙烯苷

復(fù)方首烏地黃丸處方由制何首烏、地黃、女貞子（酒制）、墨旱蓮等藥材加工制成，具有滋陰補(bǔ)腎、烏須黑發(fā)、壯筋骨的功效，用于腰膝酸軟、頭痛眩暈、須發(fā)早白。該藥品收載于部頒標(biāo)準(zhǔn)《中藥成方制劑》第五冊，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有理化鑒別和通則檢查，專屬性不強(qiáng)。該藥品中制何首烏為君藥，二苯乙烯苷是君藥的主要成分之一，故采用高效液相色譜法測定二苯乙烯苷的含量，為鑒別該藥品提供科學(xué)的依據(jù)。

1　儀器與試藥

LC-20AD型高效液相色譜儀、二元泵、二極管陣列檢測器（日本島津公司），色譜柱：WIech UItimateRXB－C18（250mm× 4.6mm，5μm）；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器，工作頻率40Hz，超聲電功率300W（昆山市超聲儀器有限公司）；AB265-S電子十萬分之一分析天平（梅特勒-托利多公司）；2550型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純；2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-0-/3-D-葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)：110844-201310，中國食品藥品檢定研究院）；復(fù)方首烏地黃丸（批號(hào)：120901、130101、130601，通藥制藥集團(tuán)股份有限公司）。

2　方法與結(jié)果

2.1二苯乙烯苷含量測定

2.1.1檢測波長的選擇：精密稱取二苯乙烯苷適量，加稀乙醇溶解，制成每1mL含0.013mg/mL的二苯乙烯苷溶液，用紫外-分光光度計(jì)，在200～800nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果在320nm波長處有最大吸收，故選320nm為檢測波長。

2.1.2色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：色譜柱：WIech UItimateRXB－C1（8250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（18∶82）；柱溫：25℃；流速：1mL/min；檢測波長：320nm。理論板數(shù)按二苯乙烯苷峰計(jì)算可達(dá)7000，在此條件下，二苯乙烯苷與其他成分達(dá)到基線分離。

2.1.3對(duì)照品溶液的制備：取二苯乙烯苷5.23mg，置10mL量瓶中，加稀乙醇制成0.523mg/mL，搖勻，作為儲(chǔ)備液；取儲(chǔ)備液1.0mL置10mL量瓶中，加稀乙醇制成0.0523mg/mL，搖勻，備用。

2.1.4供試品溶液的制備：取樣品的粉末約1g，置25mL量瓶中，加稀乙醇近刻度，超聲15min，放冷，加稀乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，以0.45μm有機(jī)濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.1.5陰性對(duì)照溶液的制備：按制劑工藝制備缺酒制何首烏的樣品，同法（2.1.4）制得陰性對(duì)照液。

2.1.6專屬性試驗(yàn)：吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液以及陰性對(duì)照溶液各10μL，分別注入色譜儀，同法測定，結(jié)果在二苯乙烯苷峰的相應(yīng)位置及保留時(shí)間上，陰性對(duì)照無干擾，見下圖。

2.1.7線性關(guān)系考察：取對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣1、2、5、10、15、20μL，記錄色譜圖，以二苯乙烯苷進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，以峰面積平均值為縱坐標(biāo)，計(jì)算得回歸方程為：y=3.5×106x-43110（n= 6），R=0.9999，結(jié)果表明二苯乙烯苷在0.052～1.05μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.1.8精密度試驗(yàn)：精密吸取供試品溶液進(jìn)樣10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，二苯乙烯苷峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.74%，表明進(jìn)樣方法和儀器精密度良好。

2.1.9重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取樣品粉末6份，按“2.1.3”項(xiàng)下條件制備樣品溶液，精密吸取10μL，進(jìn)樣分析，二苯乙烯苷峰面積的RSD為0.94%（n=6），方法重現(xiàn)性良好。

2.1.10穩(wěn)定性試驗(yàn)考察：精密吸取供試品溶液10μL，按色譜條件，分別在3、6、9、12、15、24、48h進(jìn)樣測定，結(jié)果表明二苯乙烯苷在48h內(nèi)穩(wěn)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.53%。

2.1.11加樣回收率試驗(yàn)：精密稱取已知二苯乙烯苷含量的復(fù)方首烏地黃丸樣品，分別加入二苯乙烯苷對(duì)照品溶液適量按供試品溶液制備并測定，計(jì)算回收率，二苯乙烯苷的平均加樣回收率為99.42%（RSD=0.52%）。

表1　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.1.12樣品含量測定：分別取不同批號(hào)的樣品，按本法的測定條件，分別測定各樣品中二苯乙烯苷的含量，結(jié)果見表2。

表2　樣品含量測定結(jié)果（n=3）

3　討論

3.1本文采用高效液相色譜法測定何首烏中二苯乙烯苷的含量，該法專屬性強(qiáng)，靈敏，簡便快速，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確可靠。

3.2流動(dòng)相的考察，本次實(shí)驗(yàn)對(duì)多種比例：40∶60、30∶70、20∶80、18∶82等的乙腈—水進(jìn)行比較，結(jié)果表明以乙腈—水（18∶82）最理想，分離效果好，理論塔板數(shù)在7000以上。

3.3在供試品溶液的制備中，選用加稀乙醇超聲15min[1]，加稀乙醇加熱回流30min[2]，加稀乙醇超聲40min[3]，加稀乙醇加熱回流30min[4]，結(jié)果：4種方法比較，RSD=0.66%。故選用加稀乙醇超聲15min制備供試品溶液，省時(shí)，操作簡便，提取完全。

3.4本品制何首烏為君藥，具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨、化濁降脂作用，有效成分為二苯乙烯苷，因此測定復(fù)方首烏地黃丸二苯乙烯苷的含量，對(duì)控制復(fù)方首烏地黃丸的質(zhì)量，保證療效有一定意義。

參考文獻(xiàn)

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Determ ining content of 2，3，5，4'-Stibene Glycoside in Shouwu Dihuang Compound Pill by HPLC

Le Zhengyong Nie Minghua Zeng Fangli LiMin（Zunyi Institute for Food and Drug Control，Zunyi563000）

Abstract：Objective：To establish method for determining the content of 2，3，5，4'-tetrahydroxy stilbene-2-O-β-D-glycoside（simply named as 2，3，5，4'-stilbene glycoside）from Radix Polygoni Multiflori Prepareparata in Shouwu Dihuang Compound Pill by HPLC. Methods：Itwas performed by HPLCwith WIech UItimateRXB－C18（250mm×4.6mm，5μm）.Themobile phasae consisted of acetonitrile and wate（r 18∶82）.The flow rate was 1.0mL·min-1with the detection wavelength at 320nm.Results：2，3，5，4'-stilbene glycoside showed a good linear relationship within the range of 0.052～1.05μg（R=0.9999）.The average recovery was 99.42%with RSD=0.52%，（n=6）. Conclusion：The method is simple，rapid，accurate and reliable，and it can be applied to control the quality of Shouwu Dihuang Compound Pill.

Key words:Shouwu Dihuang Compound Pill Radix PolygoniMultiflori Prepareparata 2，3，5，4'-stibene glycoside

中圖分類號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-8351（2016）01-0005-02