張齊梅，周 驄，伍寶琴，聶敏海

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周黏膜科，四川瀘州 646000）

槲皮素對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌ISG15表達(dá)及細(xì)胞遷移侵襲影響*

張齊梅，周 驄，伍寶琴，聶敏海

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周黏膜科，四川瀘州 646000）

目的：探討槲皮素對(duì)人口腔鱗狀細(xì)胞癌SCC-15細(xì)胞株中干擾素刺激基因15（interferon stimulated gene 15，ISG15）的表達(dá)及細(xì)胞遷移侵襲能力的影響。方法：培養(yǎng)人口腔鱗狀細(xì)胞癌SCC-15細(xì)胞株，槲皮素干預(yù)后，Western blotting法檢測(cè)ISG15蛋白表達(dá)水平，劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移，Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果：槲皮素干預(yù)人口腔鱗癌SCC-15細(xì)胞株24 h后，ISG15蛋白表達(dá)、細(xì)胞遷移及侵襲能力均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：槲皮素干預(yù)后能夠降低人口腔鱗癌SCC-15細(xì)胞株ISG15表達(dá)，抑制細(xì)胞遷移、侵襲能力。

口腔鱗狀細(xì)胞癌；槲皮素；干擾素刺激基因15

口腔鱗狀細(xì)胞癌 （oral squamous cell carcinomas，OSCC）屬于人類頭頸部常見的惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率高、死亡率高、存活率低等特點(diǎn)[1]。目前對(duì)OSCC發(fā)病機(jī)制研究仍不清楚，其治療效果也不理想。在眾多機(jī)制中，泛素-蛋白酶體通路（ubiquitin proteasome pathway,UPP）可能具有重要作用。有研究指出由于UPP具有降解細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的作用，因此UPP可能參與了OSCC的發(fā)生發(fā)展過程[2]。干擾素刺激基因15（interferon stimulated gene 15，ISG15）是由I型干擾素誘導(dǎo)后高表達(dá)的小分子量蛋白質(zhì)，是UPP通路上游調(diào)節(jié)因子，目前已發(fā)現(xiàn)ISG15在眾多腫瘤中高表達(dá)。 UPP與ISG15在腫瘤中的表達(dá)差異可能與腫瘤發(fā)展有關(guān)，比如在前列腺癌中，ISG15表達(dá)增加而泛素化蛋白相應(yīng)減少[3]，但I(xiàn)SG15在口腔鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)尚不清楚，因此研究ISG15在OSCC中的表達(dá)具有重要意義。槲皮素（quercetin，Que）作為一種具有抗炎 、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤的黃酮類化合物，可能對(duì)OSCC具有一定抑制作用，但目前研究較少[4]。因此本文旨在通過檢測(cè)槲皮素干預(yù)對(duì)人口腔鱗癌SCC-15細(xì)胞株中ISG15的蛋白表達(dá)以及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲能力改變，探討槲皮素對(duì)OSCC的治療效果和機(jī)制影響。

1 材料與方法

1.1 材料

槲皮素（Sigma公司，純度98%，溶于DMSO中，終濃度低于1‰）；兔抗人β-actin、ISG15多克隆抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（Abcam公司）。人口腔鱗狀癌SCC-15細(xì)胞株（購自上海拜力生物有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 ISG15蛋白提取及檢測(cè)

SCC-15（oral squamous cell carcinoma）細(xì)胞株采用含L-谷氨酸和10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，每隔3~5 d傳代1次。將細(xì)胞分為SCC-15組與槲皮素組，細(xì)胞傳代后待細(xì)胞鋪滿瓶底，SCC-15組僅給予培養(yǎng)基，槲皮素依據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)，選擇100 μmol/L作為干預(yù)濃度，因此槲皮素組給予槲皮素100 μmol/L，干預(yù)時(shí)間為24 h[5]。24 h后將細(xì)胞用胰酶消化后收集，之后加入預(yù)冷的RIPA裂解液 （50 mM Tris-base,1 mM EDTA,150 mM NaCl,0.1%SDS,1%TritonX-100,1%Sodium deoxycholate）600 μl，冰上裂解50 min，4℃、12 000 r/ min離心5 min，用BCA法測(cè)蛋白濃度。上樣量為40 μg，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，100 V恒壓轉(zhuǎn)膜，50 g/L脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入適當(dāng)濃度一抗（ISG15 1∶800，β-actin 1∶2 000），冰箱4度孵育過夜，之后PBST漂洗15 min×3次，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（羊抗兔1∶1 000），室溫孵育1 h，PBST漂洗15 min×3次?；瘜W(xué)試劑發(fā)光，曝光并采集圖像，Image Lab軟件3.0版分析目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參條帶的灰度值，取三次試驗(yàn)平均值作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。

1.2.2 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞分為SCC-15組與槲皮素組，采用劃痕法觀察槲皮素對(duì)SCC-15細(xì)胞遷移能力的影響。先在6孔板后劃出均勻橫線，胰酶消化制備單細(xì)胞懸液后將細(xì)胞按5×105/ml加入6孔板中，24 h后用槍頭劃痕。槲皮素組給予槲皮素100 μmol/L。24 h后拍照，image proplus 6.0軟件分析，計(jì)算遷移率。遷移率=（初始邊緣距離-24 h后邊緣距離）/初始邊緣距離。

1.2.3 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

SCC-15細(xì)胞侵襲分組同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，采用BD公司的基質(zhì)膠包被的侵襲小室 （growth-factor depleted Matrigel invasion chambers）觀察槲皮素對(duì)SCC-15細(xì)胞侵襲能力的影響。在Matrigel chambers加入500 μl不含血清的DMEM培養(yǎng)基中室溫放置1 h，使基質(zhì)膠水化，再棄多余培養(yǎng)基。下室孔板內(nèi)加入750 μl含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基。胰酶消化并離心收集細(xì)胞，用含0.1%BSA的DMEM重懸細(xì)胞至4×105/ml，取200 μl加入上室。槲皮素組給予槲皮素100 μmol/L，干預(yù)時(shí)間為24 h。24 h后，用棉簽?zāi)ㄈド鲜椅茨艽┠さ募?xì)胞，用100%甲醇固定10 min。用0.1%結(jié)晶紫染色細(xì)胞并在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對(duì)SCC-15細(xì)胞株中ISG15蛋白表達(dá)影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SCC-15細(xì)胞株中ISG15蛋白表達(dá)增加，蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參條帶的灰度值比值為1.82±0.11。槲皮素100 μmol/L干預(yù)后，SCC-15細(xì)胞株中ISG15蛋白表達(dá)減少，蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參條帶的灰度值比值為1.02±0.08，與SCC-15組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

2.2 槲皮素對(duì)SCC-15細(xì)胞株遷移和侵襲能力影響

細(xì)胞遷移結(jié)果顯示，24 h后SCC-15組細(xì)胞株的遷移率為（42.5±5.57）%，槲皮素100 μmol/L干預(yù)后遷移率為（11.34±1.79）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

細(xì)胞侵襲結(jié)果顯示，SCC-15組細(xì)胞穿膜個(gè)數(shù)為（112.20±24.36）個(gè)，槲皮素100 μmol/L干預(yù)后穿膜細(xì)胞數(shù)為（28.87±6.47）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示槲皮素能顯著降低人口腔鱗狀細(xì)胞癌SCC-15細(xì)胞株的遷移和侵襲能力，表明槲皮素具有一定抑制人口腔鱗狀細(xì)胞癌SCC-15細(xì)胞運(yùn)動(dòng)力。

3 討論

ISG15結(jié)構(gòu)與泛素類似，屬于類泛素修飾蛋白，是一種干擾素誘導(dǎo)后產(chǎn)生的小分子量蛋白質(zhì)[6]。ISG15可通過一系列酶系反應(yīng)調(diào)節(jié)靶蛋白的作用，參與免疫調(diào)節(jié)及腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前已發(fā)現(xiàn)有200多種作用于ISG15的靶蛋白[7-9]。ISGl5蛋白表達(dá)差異較大，表現(xiàn)在不同腫瘤細(xì)胞、同一組織來源的腫瘤細(xì)胞均存在差異[10]。槲皮素及其衍生物具有包括抗腫瘤在內(nèi)的多種生物學(xué)活性，具有較廣的抗瘤譜，對(duì)前列腺癌等多種腫瘤具有抑制作用[11]。為研究ISG15蛋白在人口腔鱗狀癌SCC-15細(xì)胞株中表達(dá)情況以及篩選針對(duì)ISG15蛋白的藥物，本研究通過免疫印跡法比較ISG15蛋白在SCC-15細(xì)胞株的表達(dá)以及槲皮素干預(yù)后ISG15在OSCC中表達(dá)的差異，推測(cè)槲皮素是否通過干預(yù)ISG15蛋白表達(dá)抑制人口腔鱗癌細(xì)胞。結(jié)果顯示，與100 μmol/L的槲皮素干預(yù)后比較，ISG15蛋白在人口腔鱗狀癌SCC-15細(xì)胞株中表達(dá)增加，提示100 μmol/L的槲皮素能夠明顯抑制人口腔鱗狀細(xì)胞癌 SCC-15細(xì)胞株中ISG15蛋白表達(dá)。

腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與細(xì)胞侵襲、遷移能力有關(guān)，因此本研究還進(jìn)一步檢測(cè)了槲皮素對(duì)OSCC侵襲、遷移能力影響，細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，24 h后SCC-15組細(xì)胞株的遷移率為（42.5±5.57）%，槲皮素100 μmol/L干預(yù)后遷移率為（11.34±1.79）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。細(xì)胞侵襲結(jié)果顯示，SCC-15組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)為（112.20±24.36）個(gè)，槲皮素100 μmol/L干預(yù)后穿膜細(xì)胞數(shù)為（28.87±6.47）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。提示槲皮素能夠抑制人口腔鱗狀細(xì)胞癌SCC-15細(xì)胞運(yùn)動(dòng)力，表現(xiàn)在槲皮素能降低人口腔鱗狀細(xì)胞癌SCC-15細(xì)胞株的遷移和侵襲能力。

綜上所述，本研究顯示槲皮素可能對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌有抑制作用，其機(jī)制與抑制ISG15表達(dá)，抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移與細(xì)胞侵襲有關(guān)，其是否還通過其他機(jī)制干預(yù)口腔鱗狀細(xì)胞癌還可進(jìn)一步研究。

圖1 槲皮素對(duì)SCC-15細(xì)胞株中ISG15蛋白表達(dá)影響

圖2 槲皮素對(duì)SCC-15細(xì)胞株遷移能力影響

圖3 槲皮素對(duì)SCC-15細(xì)胞株侵襲能力影響

1.Van Zyl A,Bunn BK.Clinical features of oral cancer[J]. SADJ,2012,67（10）:566-569.

2.Glickman MH,Ciechanover A.The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway:destruction for the sake of construction[J].Physiol Rev,2002,82（2）:373-428.

3.Desai SD,Haas AL,Wood LM,et al.Elevated expression of ISG15 in tumor cells interferes with the ubiquitin/26S proteasome pathway[J].Cancer Res,2006,66（2）:921-928.

4.Martínez-Flórez S,González-Gallego J,Culebras JM,et al.Flavonoids:properties and anti-oxidizing action[J]. Nutr Hosp,2003,17（6）:271-278.

5.Mutlu Altunda?E,Kasac?T,Y?lmaz AM,et al.Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer（B-CPAP）cells[J].J Thyroid Res,2016:9843675.

6.Reich N,Evans ?B,Levy D,et al.Interferon-induced transcription of a gene encoding a 15-kDa protein depends on an upstream enhancer element[J].proceeding of the Nationd Academg of Science,1987,84（18）:6394-6398.

7.Husnjak K,Dikic I.Ubiquitin-binding proteins:decoders of ubiquitin-mediated cellular functions[J].Annu Rev Biochem,2012,81:291-322.

8.Jeon YJ,Yoo HM,Chung CH.ISG15 and immune diseases[J].Biochim Biophys Acta,2010,1802（5）:485-496.

9.Li C,Wang J,Zhang H,et al.Interferon-stimulated gene 15（ISG15）is a trigger for tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma[J].Oncotarget,2014,5（18）: 8429-8441.

10.Andersen JB,Aaboe M,Borden EC,et al.Stage-associated overexpression of the ubiquitin-like protein,ISG15,in bladder cancer[J].Br J Cancer,2006,94（10）:1465-1471.

11.張軍暉，邢念增，康寧，等.槲皮素對(duì)TRAMP-C2前列腺癌細(xì)胞的抑制作用[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2006，23（10）：1240-1241.

（2016-03-14收稿）

Effects of quercetin on the expression of ISG15 and the migration and invasion of oral squamous cell carcinoma

Zhang Qimei，Zhou Cong,Wu Baoqin,Nie Minhai

Department of Periodontics and Oral Medicine,the Affiliated Stomatological Hospital of Southwest Medical University,Luzhou，Sichuan Province 646000，China

ObjectiveTo investigate the effects of quercetin on the expression of ISG15 and the migration and invasion of oral squamous cell carcinoma.Methods:Oral squamous cell carcinoma cell line,SCC-15 was treated with quercetin,and the expression of ISG15 was determined by Western blotting.The invasion and migration of SCC-15 were determined by wound healing assay and transwell assay respectively.Results:After 24 hours quercetin treatment,the expression of ISG-15,and the invasion and migration of SCC-15 were decreased significantly（P＜0.05）.Conclusion:Our results show that quercetin could inhibit ISG15 expression and the invasion and migration of SCC-15 cells.

Oral squamous cell carcinomas;Quercetin;Interferon stimulated gene 15

R780.1

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.03.013

*四川省科技廳課題（2014LY-62）

張齊梅（1977-），女，主治醫(yī)師，碩士。

聶敏海（1967-），男，教授。E-mail：nieminhai@126.com