孟繁榮 牛 群 雷 杰 劉煒雯 譚守勇 劉志輝

一次性完成結(jié)核分枝桿菌鑒定與利福平耐藥突變基因檢測的新方法

孟繁榮 牛 群 雷 杰 劉煒雯 譚守勇 劉志輝

目的建立一種可同時進行結(jié)核分枝桿菌鑒定并檢測結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變基因的分子方法。方法以“TGTTCTTCAAGGAGAAGCG”、“TCGTCGGCGGTCAGGTA”為上下游引物對101株結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及52株非結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進行rpoB基因擴增及序列測定，并應(yīng)用BLAST數(shù)據(jù)庫和DNAMAN軟件進行菌種與rpoB基因突變分析。結(jié)果在153例分枝桿菌臨床分離株中，104例鑒定為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，49例被鑒定為非結(jié)核分枝桿菌，與16SrDNA基因序列鑒定方法符合率為96.73%，與傳統(tǒng)分枝桿菌菌種鑒定方法符合率為83%;在104例鑒定為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌株中，54例被檢測到rpoB基因突變，與比例法檢測利福平耐藥表型的符合率為96.15%。結(jié)論應(yīng)用本引物進行rpoB基因序列分析可以一次性完成結(jié)核分枝桿菌鑒定與利福平耐藥突變基因檢測工作，有較大的臨床應(yīng)用價值。

菌種鑒定;序列分析;利福平耐藥

【Author's address】 Guangzhou Chest Hospital，Guangzhou，510095，China

耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)是結(jié)核病控制與臨床診療中的難題。目前其診斷主要依據(jù)臨床分離菌株的抗結(jié)核藥物敏感性結(jié)果，實驗過程包括分枝桿菌分離培養(yǎng)、菌種鑒定和結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗，過程繁瑣，耗時長，即便是目前較為快速先進的MGIT960也需4周左右，難以滿足臨床早期診斷的需求。涂片染色抗酸菌檢查簡便、快速，但不能鑒別分枝桿菌菌種和指示細(xì)菌耐藥性，不能診斷MDR-TB?，F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用為結(jié)核桿菌耐藥性判斷帶來了更多選擇，在方法學(xué)上可實現(xiàn)快速的要求。研究顯示:90%以上的RPF耐藥結(jié)核分枝桿菌對INH同時表現(xiàn)耐藥，說明RFP耐藥性測定是MDR-TB診斷的良好標(biāo)志物［1-3］。而高達(dá)95%以上的耐RFP結(jié)核分枝桿菌的分子機制是由于編碼 RNA聚合酶 β亞基(RNA Polymerase B，rpoB)的基因某個特定區(qū)域的突變［4-5］。亦有報道指出:不同分枝桿菌具有各自不同的rpoB基因序列，對其基因序列進行分析可將分枝桿菌鑒定至種的水平［6-8］。因此，有望通過對rpoB基因特定序列的分析一次性完成對結(jié)核分枝桿菌的鑒定和RFP耐藥性檢測，從而實現(xiàn)對MDR-TB的快速、準(zhǔn)確診斷。本研究即是對此進行一些嘗試，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)株 來源于廣州地區(qū)分枝桿菌菌種保藏庫，共9株，分別為:結(jié)核H37Rv(ATCC27294)、恥垢分枝桿菌(ATCC19420)、堪薩斯分枝桿菌(ATCC12478)、胞內(nèi)分枝桿菌(ATCC13950)、鳥分枝桿菌(ATCC25291)、龜分枝桿菌(ATCC35749)、不產(chǎn)色分枝桿菌(ATCC19530)、瘰疬分枝桿菌(ATCC19981)、愛知分枝桿菌(ATCC27280)。

1.1.2 153株分枝桿菌臨床分離株均取自于我院“廣州地區(qū)分枝桿菌菌種保藏庫”，包括結(jié)核分枝桿菌96株、鳥胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群21株、龜膿腫分枝桿菌復(fù)合群11株、牛分枝桿菌5株、偶然分枝桿菌5株、恥垢分枝桿菌2株、次要分枝桿菌1株、戈登分枝桿菌1株、海魚分枝桿菌1株、潰瘍分枝桿菌1株、瘰疬分枝桿菌1株、瑪爾摩分枝桿菌2株、嗜血分枝桿菌2株、兔分枝桿菌1株、亞洲分枝桿菌1株、猿分枝桿菌2株。

1.2 主要試劑儀器

通用基因組小量抽提試劑盒(上海生工生物工程有限公司)，Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司)，瓊脂糖粉(Gene公司)，Goldview核酸染料(鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)，PCR擴增儀(BIO RAD公司C1000TM Thermol Cycle系列)，電泳槽(BIO RAD公司PowerPac系列)，凝膠成像系統(tǒng)(BIO RAD公司Gel DocTM XR+)

1.3 rpoB基因、16SrDNA基因擴增及測序

1.3.1 引物設(shè)計

分枝桿菌rpoB基因擴增引物是在利用DNAMAN軟件比對了已知各種分枝桿菌rpoB基因序列的基礎(chǔ)上，在各分枝桿菌相同的序列區(qū)設(shè)計，擴增出的目的片段應(yīng)包含 rpoB耐藥決定區(qū)序列，如下: rpoBF-5’TGTTCTTCAAGGAGAAGCG3’;rpoBR-5’TCGTCGGCGGTCAGGTA3’，擴增片段長度為709-715bp，由英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成;16SrDNA擴增引物直接引用自文獻報道［9］，由英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。

1.3.2 基因組DNA的提取 依照試劑盒說明書。

1.3.3 基因擴增

總反應(yīng)體系為50μL，包括:10×PCR緩沖液5μL、dNTP(各2.5mmol/L)4μL、上下游引物(10μmol/L)各2μL、模板3μL、Taq DNA聚合酶0.5μL和去離子水33.5μL;PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5min后，進入循環(huán)95℃變性30 s，56℃(16SrDNA為53℃)退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)，最后72℃延伸5min。取4μL PCR產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像系統(tǒng)檢查結(jié)果。PCR擴增產(chǎn)物送英濰捷基生物技術(shù)公司測序，測序引物同PCR擴增引物。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有標(biāo)本rpoB基因、16SrDNA測序結(jié)果利用美國PubMed網(wǎng)站“局部序列比對基本檢索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)”比對分析，“Max score”“Total score”“Query cover”值最大，“E value”值為“0”，“Ident”值為100%者對應(yīng)的菌種為最終鑒定結(jié)果。對鑒定為結(jié)核分枝桿菌的序列同時利用DNAMAN軟件與結(jié)核分枝桿菌HRv37標(biāo)準(zhǔn)株rpoB基因序列比對。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

以16SrDNA基因序列測定方法為標(biāo)準(zhǔn)，計算新方法的菌種鑒定結(jié)果與之符合率;以傳統(tǒng)分枝桿菌菌種鑒定方法為標(biāo)準(zhǔn)，計算新方法的菌種鑒定結(jié)果與之符合率;以利福平藥物敏感性比例法檢測方法為標(biāo)準(zhǔn)，計算新方法對利福平藥物敏感性判定結(jié)果與其符合率。

2 結(jié)果

2.1 rpoB、16SrDNA基因擴增和測序結(jié)果

153株結(jié)核分支桿菌復(fù)合群與非結(jié)核分支桿菌均成功提取基因組DNA，并擴增得到長度分別在709～715、570～580 bp的 rpoB、16SrDNA基因片段，見圖1。與此同時，對rpoB、16SrDNA基因擴增產(chǎn)物進行了DNA測序，測序圖例見圖2。

圖2 擴增產(chǎn)物測序結(jié)果圖例

2.2 菌種鑒定結(jié)果

153例分枝桿菌臨床分離株中，經(jīng)rpoB基因分析后，104例為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，14例為胞內(nèi)分枝桿菌，12例為膿腫分枝桿菌，4例為偶然分枝桿菌，1例為亞洲分枝桿菌，7例為Mycobacteirum Colombiense分枝桿菌，3例為鳥分枝桿菌，3例為Parascrofulaceum分枝桿菌，1例為 Sinense分枝桿菌，1例triplex分枝桿菌，1例為Vulneris分枝桿菌，1例被鑒定為Septicum或Vulneris，1例不能鑒定菌種，以16SrDNA基因序列鑒定方法為標(biāo)準(zhǔn)，其鑒定準(zhǔn)確率為96.73%;以傳統(tǒng)分枝桿菌菌種鑒定方法為標(biāo)準(zhǔn)，其鑒定準(zhǔn)確率為83%。

2.3 利福平耐藥基因突變結(jié)果

被鑒定為結(jié)核/牛分枝桿菌的104株菌，50株無rpoB基因突變，判定為對RFP敏感;54株存在rpoB基因突變，突變位點及例數(shù)分別為:511位4例，513位1例，516位11例，526位9例，531位29例，判定為對RFP耐藥。與比例法檢測利福平耐藥表型的符合率為96.15%。

3 討論

本研究通過對各分枝桿菌rpoB基因序列分析，設(shè)計特異引物擴增包括第3個高可變區(qū)序列和利福平耐藥基因決定區(qū)序列在內(nèi)的rpoB基因片段，利用Gene Bank BLAST、DNAMAN軟件進行序列分析而達(dá)到分枝桿菌菌種鑒定與利福平耐藥性檢測的目的。

研究對153例臨床分離株中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、鳥胞內(nèi)復(fù)合群、龜膿腫復(fù)合群、偶然分支桿菌、亞洲分支桿菌、Colombiense分枝桿菌、Parascrofulaceum分枝桿菌、Sinense分枝桿菌的鑒定結(jié)果與具有細(xì)菌系統(tǒng)分類“金標(biāo)準(zhǔn)”之稱的16SrDNA基因菌種鑒定的結(jié)果一致，鑒定符合率高達(dá)96.73%，說明本方法在分枝桿菌菌種鑒定方面具有較高準(zhǔn)確性。然而除1株不能被本方法鑒定外尚有4株鑒定結(jié)果與16SrDNA基因鑒定結(jié)果不同，究其原因，可能是Gene Bank中保存的分枝桿菌rpoB基因序列種類不夠全面甚至有些序列只是一些片段而導(dǎo)致比對中存在錯漏。以傳統(tǒng)分枝桿菌菌種鑒定方法為標(biāo)準(zhǔn)，本研究可以對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、鳥胞內(nèi)復(fù)合群、龜膿腫復(fù)合群、偶然分枝桿菌作出準(zhǔn)確的鑒定，滿足了對臨床常見非結(jié)核分枝桿菌鑒定的要求。本研究的菌種鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)分枝桿菌菌種鑒定方法符合率稍低，準(zhǔn)確率為83%，除了Gene Bank本身存在的缺陷外，傳統(tǒng)的菌種鑒定方法操作過程繁瑣，影響因素多，對檢驗人員專業(yè)知識的高度要求及依據(jù)經(jīng)驗判斷也是導(dǎo)致其鑒定結(jié)果容易出現(xiàn)偏差的原因。

95%以上的結(jié)核分枝桿菌對利福平耐藥是因為rpoB基因507～533位的81個堿基區(qū)域的突變所導(dǎo)致［4-5］，而對利福平耐藥的結(jié)核分枝桿菌通常也同時對異煙肼耐藥，rpoB基因突變檢測對于診斷耐多藥結(jié)核病的重要性可見一斑。對本研究中被rpoB基因鑒定為結(jié)核/牛分枝桿菌的104株菌，同時進行rpoB基因突變性分析，其中54株被判定為對RFP耐藥，50株判定為對RFP敏感，與比例法檢測利福平耐藥表型的符合率為96.15%，具有非常高的準(zhǔn)確性。新的分子生物學(xué)方法諸如利福平耐藥實時熒光定量PCR技術(shù)(Xpert MTB/RIF)可在2 h內(nèi)完成臨床樣品的結(jié)核分枝桿菌及其利福平耐藥性檢測，以其較高的敏感性和特異性得到WHO的認(rèn)可和推薦［10-13］。但其只能檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，對目前臨床日漸上升的非結(jié)核分枝桿菌無檢測能力。而本研究則做到了在鑒定分枝桿菌菌種的同時完成利福平耐藥基因的檢測。

綜上所述，本研究方法可以準(zhǔn)確區(qū)分結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌，雖然對非結(jié)核分枝桿菌某些菌種的鑒定存在不確定性，但對臨床常見的非結(jié)核分枝桿菌菌種具有良好的鑒別，特別是對廣州市臨床分離株中非結(jié)核分枝桿菌構(gòu)成比在前4位［14］的龜膿腫分枝桿菌復(fù)合群，鳥胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群、偶然分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌有良好區(qū)分，并可同時準(zhǔn)確檢測rpoB基因突變判斷結(jié)核分枝桿菌對利福平耐藥性，從而為MDR-TB的診斷提供一定參考。然而本研究中選用的分枝桿菌參考菌株數(shù)量有限，僅9種，本方法是否對現(xiàn)有一百多種分枝桿菌均有良好的擴增能力及鑒別能力仍值得我們做進一步驗證。

同時，鑒于痰涂片抗酸染色檢查的快捷方便性，對于沒有條件完成基因擴增與序列測定的基層醫(yī)療單位，可以考慮將痰涂片送至高級實驗室進行檢測。那么，利用本研究引物直接從痰涂片標(biāo)本中擴增特定rpoB基因片段同時完成分枝桿菌菌種鑒定與利福平耐藥性檢測，將是我們進一步努力的方向。

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An Innovative Method for Identificatng Mycobacterium Tuberculosis and Indicating It's Rifampin Resistance Simultaneously

MENG Fanrong，NIU Qun，LEI Jie，et al

ObjectiveTo establish a new method for identification of mycobacteria tuberculosis and rpoB gene mutation of rifampicin resistance.MethodsA pair of specific primer for amplification of the third hypervariable region and rifampicin resistance determining region in Mycobacterium genome was designed.The rpoB gene segment of96 mycobacterium tuberculosis complex strains and57 nontuberculosis mycobacteria was amplified and sequenced used by this specific primer and all of the gene sequences were analyzed by BLAST and DNAMAN software.ResultsAmong the153 clinical isolates，one hundred and four were identified as mycobacterium tuberculosis complex and49 as nontuberculosis mycobacteria，including14 mycobacterium intracellular，12 mycobacterium abscessus，4 mycobacterium fortuitum，1 mycobacterium asiaticum，7 mycobacterium colombiense，3 mycobacterium avium，3 mycobacterium parascrofulaceum，1 mycobacterium sinense，1 mycobacterium triplex，1 mycobacterium vulneris and1 mycobacterium septicum/vulneris.One case could not be identified.Compared with the16SrDNA gene，the accuracy rate of this new method was96.73%;Compared with the traditional method，its accuracy rate was83%.In104 cases identified as mycobacterium tuberculosis complex，there were54 cases detected rpoB gene mutation which was determined resistant to RFP while50 cases had no mutation and determined sensitive to RFP.Compared with traditional drug sensitivity test，the accurate rate of this new method was96.15%.ConclusionThis new method is very useful because it can be identification of common mycobacterium species and detection the rifampin resistant through rpoB gene sequence analysis by only one test.

Strain Identification;Sequential Analysis;Rifampicin Resistance

R446.7;R378.91+1

:Adoi:10.3969/j.issn.1671-332X.2016.08.002

廣東省科技計劃項目(編號:2011B061300085);廣東省科技計劃項目(編號:2011B031800377);廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目(編號:20151A011036);廣州市科技計劃項目(編號:155700012)

孟繁榮 牛 群 雷 杰 劉煒雯 譚守勇 劉志輝:廣州市胸科醫(yī)院 廣東廣州 510095

劉志輝