劉洋劉旭東劉文俊王凌志呂斌張立德王德山單德紅

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基于脾氣虛的脾陽虛大鼠模型的復制方法及評價標準研究*

劉洋①②劉旭東①劉文?、偻趿柚劲賲伪螈蹚埩⒌垄偻醯律舰賳蔚录t①

【摘要】目的：研究階段式大鼠脾陽虛證模型的復制方法及客觀評價標準。方法：32只SPF級雄性SD大鼠隨機分為對照組和脾陽虛證模型組（模型組），每組16只。模型組大鼠采用兩段式造模方法；第1階段，即前15 d施加飲食不節(jié)和力竭游泳刺激；第2階段，即后7 d每日早晚2次灌服番瀉葉。為質控造模過程，以臨床辨證要點為基礎，建立了大鼠脾氣虛和脾陽虛證的評價標準，并進行客觀評價。結果：與對照組比較，模型組大鼠在第1階段出現(xiàn)了消瘦、食少、神疲和乏力等癥狀，表明大鼠處于脾氣虛狀態(tài)；在第2階段，上述變化更加嚴重，且有畏寒、便溏等癥狀，提示大鼠處于脾陽虛狀態(tài)。結論：本研究中采用的兩段式造模方法和模型評價標準，能夠成功復制大鼠脾陽虛證模型。

【關鍵詞】脾陽虛； 脾氣虛； 動物模型； 大鼠； 評價標準

①遼寧中醫(yī)藥大學 遼寧 沈陽 110847

②沈陽市肛腸醫(yī)院

③溫州醫(yī)科大學

First-author’s address： Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China

脾陽虛證是中醫(yī)證候研究的重要內容，其大鼠模型的復制方法有單因素法和復合因素法，因后者更好地模擬了該證的病因病機，目前應用較多，但還存在一些急需解決的問題[1-5]。首先是模型的局限性問題。因為脾陽虛證的病因病機復雜，難以全面模擬，所以現(xiàn)有模型實為有限模型，并不具備脾陽氣證的全部內涵，必須加以限定。其次是模型復制的質控問題。復合因素造模法多為兩段式，即先復制脾氣虛，再復制脾陽虛，而模型評價僅涉及脾陽虛，缺乏過程管理[6-11]。為解決上述問題，本研究先后模擬脾氣虛證和脾陽虛證的主要病因病機，并建立了階段性評價標準以質控，成功復制了脾陽虛證的有限模型，特報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 32只SPF級雄性SD大鼠，體質量（200±10）g，購于遼寧省本溪市實驗動物中心[SCXK（遼）-2010-0001]，隨機分為對照組和脾陽虛證模型組（模型組），每組16只。大鼠飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心[SYXK（遼）-2013-000-9]，室溫18～23 ℃，相對濕度45％～55％，自由飲水進食，適應性飼養(yǎng)1周后，開始實驗。

1.2 模型復制方法 第1階段（phase 1，P1），按文獻[12]方法復制脾氣虛證模型（飲食失節(jié)＋勞倦型），即模型組大鼠在15 d內：（1）先飽食1 d，再禁食2 d，均不禁水，共5個循環(huán)；（2）每日水溫35～37 ℃游泳至力竭。第2階段（phase 2，P2），復制脾陽虛證模型（苦寒瀉下型），即每日灌服20％番瀉葉水浸劑（2 mL/100 g），早晚各1次，連續(xù)7 d。

1.3 模型評價標準 以大鼠的生物學特征為基礎，根據(jù)臨床辨證要點，擬定脾氣虛證的評價標準：消瘦，食少，神疲，乏力；脾陽虛證模型評價標準：前述標準加畏寒、便溏。

1.4 模型評價方法 分別在P1、P2，每組取8只大鼠進行評價。

1.4.1 代謝水平評價 上午9～10時測量其體質量以評價消瘦；測肛溫以評估畏寒；單只放入代謝籠24 h后計算進食/水量，即投食/水量-剩余量，以評價食少；按文獻[12]方法收集糞便，檢測大便含水率，即（大便濕重-大便干重）/大便濕重×100％，觀察便溏情況。

1.4.2 神疲評價 采用TM-Vision行為學實驗系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司），按文獻[13]方法進行檢測，即將大鼠放入箱體中心，觀察5 min內大鼠的運動距離和站立次數(shù)，徹底清潔箱體后，檢測下一只大鼠。

1.4.3 乏力評價 采用YLS-13A大小鼠抓力測定儀（濟南益延科技發(fā)展有限公司）檢測前肢抓力[13]。先用右手將大鼠按放在抓力板上，左手向前推抓力板，然后右手向后滑至鼠尾部，左手輕輕松開抓力板，待大鼠用力抓住抓力板時，及時加力后拉，以得到最大抓力。專人連續(xù)測量3次，取平均值。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以（±s）表示，比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠代謝水平 由表1可見，與對照組P1比較，模型組P1大鼠的體質量、進食量和進水量均下降，該組大鼠出現(xiàn)消瘦和食少；與對照組P2比較，模型組P2的體質量、肛溫、進食量和進水量均減少，該組大鼠出現(xiàn)了消瘦、畏寒和食少，而大便含水率增加，該組大鼠出現(xiàn)便溏；與模型組P1比較，模型組P2的體質量和肛溫均下降，但大便含水率升高。

表1　大鼠代謝水平（±s）

表1　大鼠代謝水平（±s）

*與對照組P1比較，P＜0.05；△與對照組P2比較，P＜0.01；#與模型組P1比較，P＜0.01

組別　　體質量（g）　　肛溫（℃）　　進食量（g）　　進水量（mL）　　大便含水率（％）對照組P1（n＝8）　331.47±22.46　36.35±1.04　32.31±9.61　88.9±21.4　23.56±4.62對照組P2（n＝8）　384.59±35.05　36.60±1.19　35.31±6.42　93.3±16.2　25.22±2.89模型組P1（n＝8）　239.78±12.10*　36.24±1.16　 21.05±5.21*　60.5±9.3*　20.32±9.18模型組P2（n＝8）　 192.90±24.80△#　34.41±0.74△#　15.68±3.12△　57.6±13.9△　38.25±4.42△#

2.2 大鼠神疲乏力情況 圖1和表2可見，對照組P1和P2比較無明顯差異，大鼠活動區(qū)域大，運動距離遠，站立次數(shù)多，前肢抓力大；與對照組P1比較，模型組P1和P2的活動區(qū)域明顯變小，運動距離、站立次數(shù)和前肢抓力均明顯下降，提示兩組大鼠出現(xiàn)了神疲和乏力現(xiàn)象；與模型組P1比較，模型組P2的活動區(qū)域更小，甚至沒有形成閉合運動軌跡，上述3個指標均降低，表示該組大鼠的神疲和乏力更加嚴重。

表2　大鼠神疲乏力情況（±s）

表2　大鼠神疲乏力情況（±s）

*與對照組P1比較，P＜0.05；△對照組P2比較，P＜0.01；#與模型組P1比較，P＜0.01

組別　　運動距離（cm）站立次數(shù)（次/5 min）前肢抓力（g）對照組P1（n＝8）9512.90±1881.59 20.6±5.9　 1363.54±105.83對照組P2（n＝8）8860.21±1642.03 19.4±3.2　 1494.86±139.44模型組P1（n＝8）4930.35±1253.18*15.3±3.6*　1215.54±127.72*模型組P2（n＝8） 835.78±282.61△#5.0±2.3△#1015.68±51.70△#

圖1　大鼠典型運動軌跡

3 討論

動物模型是中醫(yī)證候研究的重要內容，其復制過程應符合中醫(yī)理論，不能單純進行癥狀模擬，還應考慮病因，甚至是模擬相關病機[14-16]。通常認為，脾陽虛的發(fā)生多源于脾氣虛，也可因外寒直中、苦寒傷陽和腎陽不足。由于病因較多，本研究僅選擇了脾氣虛和苦寒傷陽兩個進行模擬，即以脾氣虛大鼠為對象，通過灌服番瀉葉，達到損傷脾陽的目的。而在復制脾氣虛模型時，首先考慮的仍然是病因病機。誘發(fā)脾氣虛的病因有飲食不節(jié)，勞倦過度，憂思日久，稟賦不足，素體虛弱，年老體衰，大病初愈，調養(yǎng)失慎等。還是由于病因較多，本研究選擇了較為常見的飲食不節(jié)和勞倦過度進行模擬，即采用飽食1 d，饑餓2 d，結合每日力竭游泳，造成脾氣虛。因此，本實驗在復制脾陽虛模型的過程中，先后施加的因素有飲食失節(jié)、勞倦過度和苦寒傷陽，分別模擬了脾氣虛和脾陽虛證的部分病因病機，同時也限定了本實驗所復制的脾氣虛為飲食不節(jié)和疲勞型，脾陽虛為脾氣虛和苦寒傷陽型。

由于模型復制為階段性，其評價也應分階段進行，從而有效質控模型復制過程。本研究依據(jù)二證的臨床辨證要點，結合大鼠的生物學特征，建立了較為簡便易行的模型評價標準。首先根據(jù)脾氣虛的臨床辨證要點，即食少、腹脹、便溏及氣虛證等，建立大鼠脾氣虛的評價標準為：消瘦，食少，神疲，乏力；其次根據(jù)脾陽虛的臨床辨證要點，即脾氣虛的癥狀加虛寒證，設立大鼠脾陽虛證的模型評價標準為：消瘦，食少，神疲，乏力，畏寒，便溏。實際上，后一評價標準為前一標準加上畏寒和便溏，即脾氣虛加寒象，這體現(xiàn)了模型評價的連續(xù)性。依此標準，本研究在造模的P1和P2進行階段性評價。探索客觀簡便的模型評價方法一直是中醫(yī)證候模型研究的重要內容，其目的是減少主觀因素對實驗的干擾，提高模型復制的成功率，確保模型復制的穩(wěn)定性，從而保證實驗結果的可重復性。針對上述評價標準，本實驗建立了較為客觀和簡便的檢測方法，以評估大鼠的類人癥狀。實際上，目前已經(jīng)能夠通過檢測大鼠的體質量、肛溫、進食/水量和大便含水率等，分別對消瘦、畏寒、食少和便溏等進行量化評價。本實驗結果顯示，模型組P1的體質量、進食/水量均低于對照組P1，但肛溫和大便含水率無明顯變化，表明大鼠在接受15 d的飲食不節(jié)和力竭游泳刺激后，出現(xiàn)了消瘦和食少，但無畏寒和便溏現(xiàn)象；模型組P2的體質量、進食/水量、肛溫均低于對照組P2，且大便含水率顯著增加，說明該組大鼠出現(xiàn)了消瘦、食少、畏寒和便溏等類人癥狀。

與上述指標不同，“神?！焙汀胺αΑ睂儆谧允鲂云诎Y狀，僅憑目測難以客觀判定大鼠的疲勞程度，特別是難以區(qū)分二者在脾氣虛和脾陽虛中的差別。本課題組前期工作提出，“神疲”和“乏力”均屬于疲勞范疇，但前者主要是中樞性，后者則為外周性，可以分別采用曠場實驗和檢測大鼠雙前肢抓力進行客觀評價[13]。本實驗觀察到，對照組P1 和P2大鼠進入檢測箱后，更多地活動于四周較暗區(qū)域，并有快速通過中心強光區(qū)域的現(xiàn)象，其運動距離遠、站立次數(shù)多，顯示這些大鼠能夠準確感知不同區(qū)域的光照強度，具有明顯的趨暗現(xiàn)象，并對新鮮環(huán)境表現(xiàn)出較強的探索能力，反映了大鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)處于明顯興奮狀態(tài)。與此相比，模型組P1和P2的活動范圍小，運動距離和站立次數(shù)均顯著降低，提示大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮度程度較低，探索“意愿”較差，處于“神?！睜顟B(tài)。在大鼠雙前肢抓力方面，結果顯示模型組P1和P2的前肢抓力分別低于對照組P1和P2，提示大鼠出現(xiàn)“乏力”表現(xiàn)。

匯總上述實驗結果，可以看出，模型組P1的體質量、進食/水量、曠場中運動距離和垂直活動次數(shù)，以及前肢抓力等，均顯著低于對照組P1，表明該組大鼠出現(xiàn)了消瘦、食少、神疲和乏力等類人癥狀，處于脾氣虛狀態(tài)。而模型組P2的上述指標與肛溫均顯著低于對照組P2，且大便含水率顯著增加，說明該組大鼠除了產生脾氣虛的類人癥狀外，還有畏寒和便溏現(xiàn)象，已經(jīng)處于脾陽虛狀態(tài)。此外，通過模型組P1和P2之間的比較，還可以發(fā)現(xiàn)脾陽虛時大鼠的體質量、肛溫、運動距離和站立次數(shù)明顯低于脾氣虛，大便含水率顯著高于脾氣虛，但兩者在進食/水量方面沒有明顯差異，這些說明從脾氣虛發(fā)展為脾陽虛時，盡管大鼠的納少癥狀沒有進一步加重，但大鼠更加消瘦，神疲和乏力更為嚴重，并出現(xiàn)了畏寒和便溏等較為明顯的寒象。

綜上所述，本研究所采用的階段式造模方法和評價標準，能夠成功地復制大鼠的有限性脾陽虛證模型，并且在消瘦、神疲、乏力、畏寒和便溏等方面與脾氣虛進行有效區(qū)分。

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Establishment and Evaluation of Rat Spleen Yang Deficiency Based on Spleen Qi Deficiency

/LIU Yang，LIU Xu-dong，LIU Wen-jun，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（03）：025-028

【Abstract】Objective： To study the two-phase model establishment of limited Spleen Yang deficiency in rats and its evaluation criterion. Method： 32 male SD rats in the SPF grade were randomly divided into control and model group of Spleen Yang deficiency （model group），each group had 16 rats. Rats in the model group were dealt with improper diet and exhausted swimming for 15 days，then bid intragastric Senna leaf for 7 days. The model establishment was monitored，objective evaluations were carried out according to the evaluation criterion of deficiencies of Spleen Qi and Yang，which were set up based on their highlights of differentiation of symptoms and signs. Result： Rats in model group showed，in the 1st phase，emaciation，less food and water intakes，physical and metal fatigue，suggesting that they were in the state of spleen qi deficiency； in the 2nd phase，rats showed more severe of forementioned symptoms，adding coldness，indicating that these rats were in the state of spleen yang deficiency. Conclusion： 2-phase model establishment in the present study can be used to establish spleen yang deficiency in rats.

【Key words】Spleen Yang deficiency； Spleen Qi deficiency； Animal model； Rat； Evaluation criterion

收稿日期：（2015-11-23） （本文編輯：蔡元元）

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.03.008

通信作者：單德紅

*基金項目：國家重點基礎研究發(fā)展計劃（973項目）（2013CB531702）