劉炎，黃鑫，楊義明，艾軍※

(1．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春?130112；?2．長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，長春?130117)

山葡萄(VitisamurensisRupr.)又名野葡萄、山浮桃、蛇葡萄等，起源于中國東北、俄羅斯遠東地區(qū)，目前，主要分布于我國吉林、遼寧、黑龍江等東北地區(qū)，其資源豐富且品種眾多。山葡萄中含有十分豐富的多酚類成分，具有很強的抗氧化、保護心血管及神經(jīng)系統(tǒng)、降血脂、抗癌、抑菌、延緩衰老等藥理作用[1～3]?；ㄉ疹惓煞质巧狡咸阎卸喾宇惓煞值闹饕M成部分，是其中含量較高的成分，也是功能性成分之一。山葡萄中的花色苷分布于果皮、果肉、葡萄籽中，果皮中含量最高[4，5]?；ㄉ帐怯苫ㄉ睾吞切纬傻奶擒眨诨ㄉ谹環(huán)3位上結(jié)合1個葡萄糖后形成單糖苷，在3位和5位上分別結(jié)合1個葡萄糖形成雙糖苷[6]。目前，分離、分析山葡萄中花色苷的方法主要是高效液相色譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7～11]。本實驗建立了高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，對中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所山葡萄資源圃中5個山葡萄品種樣本中5種花色苷單糖苷的含量進行測定和對比，為山葡萄中花色苷的研究提供方法和依據(jù)，同時也為山葡萄品質(zhì)評價方法研究提供一定的參考。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

供試山葡萄樣本均采集于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所山葡萄資源圃，品種分別為野生山葡萄選育品種左山一、左山二、通化十號、長白山九號以及種內(nèi)雜交品種雙豐。采集時間為2015年9月20日，為山葡萄成熟采收期。

1.2 對照品與試劑

花色苷對照品飛燕草素-3-O-葡萄糖苷(DEL-3-O-glucoside)、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(CYA-3-O-glucoside)、矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷(PET-3-O-glucoside)、芍藥素-3-O-葡萄糖苷(PEO-3-O-glucoside)、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷(MAL-3-O-glucoside)(長春市宏宇化工有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國Fisher公司)。

1.3 實驗儀器

Ultimate 3000液相色譜儀(美國DIONEX公司)；QTrap 4000質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司)；Milli-Q Advantage A10超純水器(美國Millipore公司)；XS205DU電子天平(1/100 000，瑞士Mettler Toledo公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC-ESI-MSn檢測條件

色譜柱：PFP Kinetix (2.1mm×50mm，2.6μm)；流動相：2%甲酸水溶液(A)-2%甲酸乙腈溶液(B)，二元梯度洗脫(0min～1min，1.2%B；1min～31min，1.2%～21.2%B；31min～37min，21%～100%B；37min～42min，100%B；42min～44min，100%～1.2%B；44min～52min，1.2%B)；流速：0.6mL/min；柱溫：35℃；進樣量：5μL。

質(zhì)譜條件：ESI離子源；負離子模式檢測；輔助氣1、2：60psi；氣簾氣：25psi；錐孔電壓：65V；入口電壓：10V；碰撞能量：26V；碰撞室出口電壓17V；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)采集模式；離子對設(shè)定：飛燕草素-3-O-葡萄糖苷(465>303)、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(449>287)、矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷(479>317)、芍藥素-3-O-葡萄糖苷(463>301)、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷(493>331)。總離子流圖見圖1。

a.飛燕草素-3-O-葡萄糖苷；b.矢車菊素-3-O-葡萄糖苷；c.矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷；d.芍藥素-3-O-葡萄糖苷；e.二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷

2.2 對照品溶液制備

精密稱取飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷、芍藥素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷各1mg，分別定容至1mL，制成濃度為1mg/mL溶液備用。

2.3 供試品溶液制備

山葡萄采集后，立即剝皮，葡萄皮干燥處理，干燥后粉碎、混勻，備用。取樣品0.1g，加入甲醇5mL，避光超聲提取5min，重復(fù)3次，合并提取液，氮氣吹干，定容至1mL，濾過，稀釋，備用。

2.4 線性關(guān)系考察

制備含飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷、芍藥素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的混合對照溶液。分別精密吸取混合對照品溶液2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、12μL，稀釋成不同濃度梯度，按“2.1”項檢測條件測定，由峰面積為縱坐標、對照品量為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程及相關(guān)系數(shù)(表1)。

表1花色苷的線性回歸方程及其相關(guān)系數(shù)

Table 1Linear regression equation and correlation coefficient of anthocyanins

2.5 精密度實驗

精密吸取同一混合對照品溶液5μL，重復(fù)進樣5次，計算色譜峰峰面積值的RSD。飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷、芍藥素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷峰面積的RSD分別為1.15%、0.32%、1.51%、1.17%、1.41%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗

分別精密吸取同一供試品溶液5μL，分別于0h、8h、16h、24h進樣，測定峰面積。飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷、芍藥素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷峰面積的RSD分別為 2.52%、2.32%、4.25%、4.73%、3.06%，RSD值均小于5%，說明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重現(xiàn)性試驗

取同一供試品5份，分別按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，并按照上述檢測條件測定。飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷、芍藥素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷RSD分別為2.67%、3.09%、2.98%、2.87%、3.15%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收率測定

精密稱取6份已知含量的同一山葡萄樣品0.1g，分別精密加“2.2”項下制備的混合對照溶液0.6mL、0.8mL、1.0mL，加入甲醇定容，按照“2.1”項下檢測條件進樣分析。飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷、芍藥素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的平均回收率分別為97.45%、98.21%、96.06%、97.63%、101.80%，RSD分別為2.21%、2.10%、2.09%、2.17%、2.19%。

3 結(jié)果與分析

5個品種山葡萄果皮中均檢測到5種花色苷，總離子流圖見圖2，含量測定結(jié)果見表2。

a.飛燕草素-3-O-葡萄糖苷；b.矢車菊素-3-O-葡萄糖苷；c.矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷；d.芍藥素-3-O-葡萄糖苷；e.二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷

由表2可以看出，5個品種山葡萄樣品中飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷含量高于矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和芍藥素-3-O-葡萄糖苷。5個品種山葡萄中飛燕草素-3-O-葡萄糖苷含量最高的為長白山九號(5.10mg/g)，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量最高的為雙豐(1.44mg/g)，矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷含量最高的為通化十號(4.07mg/g)，芍藥素-3-O-葡萄糖苷含量最高的為雙豐(1.27mg/g)，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷含量最高的為左山一(4.33mg/g)。5個品種山葡萄果皮中5種花色苷單糖苷總含量最高的為長白山九號，其次為左山一，含量最低的為左山二。

表2不同品種山葡萄樣品中花色苷含量測定結(jié)果

左山一ZuoshanⅠ左山二ZuoshanⅡ雙 豐Shuangfeng通化十號ThonghuaⅩ長白山九號ChangbaishanⅨ飛燕草素-3-O-葡萄糖苷 DEL-3-O-glucoside312±016436±019465±010399±010510±013矢車菊素-3-O-葡萄糖苷 CYA-3-O-glucoside165±009123±008144±009098±006129±009矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷 PET-3-O-glucoside335±013387±015312±011407±014385±015芍藥素-3-O-葡萄糖苷 PEO-3-O-glucoside101±006096±005127±007091±006087±005二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷 MAL-3-O-glucoside433±017129±008185±008337±012381±0165種單糖苷總量 TotalContent13461171123313321492

4 討論

本試驗采用超聲提取法，通過預(yù)實驗對料液比例、提取功率和提取時間進行優(yōu)化，確定最佳提取工藝，結(jié)果提取花色苷比較完全，提取時間短、效率高，保證了花色苷的純度，避免雜質(zhì)對HPLC-ESI-MSn法測定的干擾，減少雜質(zhì)峰。并且利用多反應(yīng)離子監(jiān)控模式(MRM)，對待測5種花色苷分別選用各自定量離子對通道進行分析，既消除了相似雜質(zhì)的干擾又提高了分析的靈敏度和檢測限。

花色苷作為功能性多酚類成分的重要組成部分，對山葡萄的質(zhì)量有著重要的影響。花色苷含量與山葡萄品種有關(guān)，同時也受生長環(huán)境中的多種因素影響。因此通過采集大量樣本，明確不同品種山葡萄花色苷的種類和含量的差異，經(jīng)過合理的統(tǒng)計與分析，所得到的結(jié)果能夠為山葡萄的品質(zhì)評價提供依據(jù)。

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