楚海嬌

(吉林農業(yè)科技學院生物工程學院，吉林?吉林?132101)

超氧化物歧化酶(Super Oxide Dismutase，SOD)是一種廣泛存在于生物體內的抗氧化酶，它能夠快速、有效地清除體內的超氧自由基[1，2]，具有防止心血管疾病、抗腫瘤、抗輻射、抗炎癥及抗衰老等作用。目前，科研人員主要從動物、植物及微生物中提取SOD，而以食用真菌為對象進行的相關研究較少[3]。有關研究表明，真菌具有一定清除羥自由基和超氧陰離子的能力[4]。香菇(Lentinusedodes)又名冬菇、北菇、厚菇，是一種常見的食用真菌，營養(yǎng)豐富。本試驗以香菇菌絲體為材料，采用直接法提取香菇菌絲體中的SOD，并對提取條件進行優(yōu)化，旨在獲得香菇菌絲體中SOD的最佳提取工藝參數(shù)，為食用菌SOD的提取純化研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

香菇(吉林農業(yè)科技學院食用菌大棚)。

1.2 主要試劑和儀器

磷酸二氫鈉(天津市瑞金特化學品公司)；磷酸氫二鈉、考馬斯亮藍G-250(天津市福晨化學試劑廠)；0.1mg/mL牛血清蛋白溶液(北京澳博星生物技術有限責任公司)；冷丙酮、氯仿、鹽酸(沈陽市新化試劑廠)；無水乙醇(天津市致遠化學試劑有限公司)；鄰苯三酚(上海源葉生物科技有限公司)。

高壓滅菌器MLS-3750(三洋電機株式會社)；電子分析天平AL204-1C(上海經(jīng)天電子儀器有限公司)；高速冷凍離心機GL-20G-IL(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；恒溫震蕩培養(yǎng)箱HZQ-F160A(上海一恒科技有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-8(金壇市科析儀器有限公司)；722型紫外分光光度計(上海佑科儀器有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1香菇液體深層發(fā)酵將香菇菌塊接種到斜面培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)7d；自香菇培養(yǎng)斜面挑取黃豆粒大小的菌絲團接入液體培養(yǎng)基中，28℃、150r/min震蕩培養(yǎng)7d～14d；再以10%的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、150r/min震蕩培養(yǎng)7d～14d，得發(fā)酵液。發(fā)酵液用300目紗布過濾，收集菌絲體，晾干稱重[5]。

1.3.2SOD的提取[6]取香菇菌絲體1g，加入3mL磷酸緩沖液，置于液氮中研磨，4℃、10 000r/min離心15min，上清液即為粗酶液。

1.3.3SOD的純化[7]向粗酶液中加入0.25倍體積的氯仿-乙醇(3∶5)溶液，充分混勻后4℃、15 000r/min離心20min，去除雜蛋白沉淀；繼續(xù)向上清液中加入0.6倍體積冷丙酮，充分混勻后4℃、15 000r/min離心20min，得到SOD沉淀；用提取緩沖液溶解，55℃熱處理15min后離心，棄沉淀得到SOD純化酶液，測定SOD活性及蛋白質含量。

1.3.4SOD提取條件的優(yōu)化分別對提取緩沖液pH、提取緩沖液體積、提取緩沖液濃度及提取次數(shù)進行優(yōu)化研究。

1.3.5SOD酶活力測定采用鄰苯三酚自氧化法進行酶活力測定。酶活力計算公式如下：U/mL=(0.070-△A325)×100%×V總/[0.070×50%·VS]。其中，△A325為反應吸光度變化值，V總為反應總體積(mL)，VS為加入樣品液的體積(mL)。

1.3.6蛋白質含量測定按表1加入試劑，在595nm下比色測定。以標準蛋白質含量為橫坐標、吸光度值為縱坐標繪制標準曲線[6]。

表1考馬斯亮藍G-250法標準曲線的制備

Table 1Coomassie brilliant blue G-250 method draw standard curve

樣品蛋白含量計算公式：蛋白質含量(mg/g)=A×X/m。式中，A為標準曲線上查得樣品蛋白質含量，X為稀釋倍數(shù)，m為稱取樣品鮮重。

2 結果與討論

2.1 牛血清蛋白標準曲線的繪制

牛血清蛋白溶液0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL為橫坐標，測得的吸光度值(OD)為縱坐標繪制標準曲線(圖1)。

2.2 提取條件的優(yōu)化

2.2.1提取緩沖液最佳pH的確定采用pH 7.2、pH 7.4、pH 7.6、pH 7.8、pH 8.0、pH 8.2的磷酸鹽緩沖液(50mmol/L)進行SOD提取，計算總酶活力和比活力。

圖1 牛血清蛋白標準曲線

表2磷酸緩沖液pH的確定

Table 2Determine of phosphate buffer pH

pH影響酶的提取及其結構，從而影響酶的活力。由表2可知，磷酸緩沖液pH為7.8時，SOD總酶活力和總蛋白含量最高，分別為180.42U和58.74mg，其他條件均有所下降，因此確定提取緩沖液pH為7.8。

2.2.2提取緩沖液濃度的確定選取濃度為30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L、60mmol/L的磷酸鹽緩沖液對SOD進行提取，并對酶活力和比活力進行檢測。結果如表3所示，磷酸緩沖液濃度在50mmol/L時，酶活力較高，對酶破壞小。因此確定磷酸緩沖液濃度為50mmol/L。

表3磷酸緩沖液濃度的確定

Table 3Determine of phosphate buffer concentration

2.2.3提取緩沖液體積的確定分別向菌絲體中加入1倍、2倍、3倍、4倍體積的磷酸鹽緩沖液，對SOD進行提取，并對酶活力和比活力進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)，當加入2倍體積的磷酸緩沖液時提取效果較好，總酶活力最高為160.44U。綜合考慮，選取2倍體積磷酸緩沖液進行提取(表4)。

表4磷酸緩沖液體積的確定

Table 4Determine of phosphate buffer volume

2.2.4提取次數(shù)的確定分別采用pH 7.8、50mmol/L磷酸鹽緩沖液抽提1次、2次、3次，并將上清液混合后測定酶活性及蛋白含量，結果見表5。當抽提次數(shù)為2次時，酶活性最高，為105.43U。確定采用直接法提取SOD的抽提次數(shù)為2次。

表5提取次數(shù)的確定

Table 5Determine of extraction times

3 結論與討論

通過對提取條件進行優(yōu)化，得出磷酸緩沖液pH 7.8、濃度50mmol/L、加入體積2倍、抽提次數(shù)2次時，能夠得到SOD的最大酶活性。

酶的比活力在酶學研究中用來衡量酶的純度，對于同一種酶來說，酶的比活力越高，酶的純度越高。本研究中SOD的比活力均較低，可考慮在盡可能減少酶活損失的情況下進一步增加純化步驟來提高純度。

目前，食用菌中SOD的提取研究部位主要集中于子實體，而以菌絲體為對象進行SOD的研究報道較少。本實驗以發(fā)酵培養(yǎng)香菇菌絲體作為材料，避免了香菇子實體不易貯藏、大量購買費用較高的缺點，比較適合大規(guī)模生產(chǎn)研究。

[1]梁華,陸芽春,李雪林.幾種食用菌清除氧自由基的研究[J].食品科學,2005,(7):94-97.

[2]武金霞,肖煒.雙孢蘑菇子實體超氧化物歧化酶(SOD)的分離純化及部分性質[J].河北大學學報:自然科學版,2002,(3):264-267.

[3]高建華,郭艷翔,劉佳賓,等.杏鮑菇菌絲體中SOD提取方法研究[J].食用菌，2007,(2):50-51.

[4]許平.蘆薈超氧化物歧化酶(SOD)的分離純化研究[J].重慶工商大學學報:自然科學版,2007,24(1):22-24.

[5]李宏,單振秀,王宜林,等.紅酵母提取SOD的研究[J].食品科學:工藝技術版,2003,24(12):81-84.

[6]鄧旭,李清彪,孫道華,等.從大蒜細胞中分離出超氧化物歧化酶[J].食品科學:工藝技術版,2001,22(9):47-49.

[7]宣景宏,孟憲軍,劉春菊,等.紅樹莓超氧化物歧化酶(SOD)的提取工藝[J].食品研究開發(fā):科學研究版,2007,28(4):90-93.