于波，孫英蓮，王英軍

(1．吉林油田總醫(yī)院藥劑科，吉林?松原?138000；?2．吉林省中醫(yī)藥科學院，長春?130012)

苜蓿(Medicago)隸屬于豆科，分布于地中海區(qū)域，西南亞、中亞、非洲和我國也有廣泛栽培，紫花苜蓿、黃花苜蓿和南苜蓿在我國被作為藥用。苜蓿全草、根在民間主要用于治療消化不良、肺熱咳嗽、黃疸、膀胱結石等癥。苜蓿屬植物含有的次生代謝產(chǎn)物主要為黃酮和皂苷類物質(zhì)，還含有葉蛋白、多糖、香豆素等活性成分。該屬植物及其提取物具有抗氧化、抗菌、護肝、降血壓、調(diào)血脂、降血糖、止痛鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、增強機體免疫力、抑制腫瘤細胞生長及改善記憶力等多種生物活性。本實驗通過大鼠Heyman’n腎小球腎炎模型，探討紫花苜蓿提取物對慢性腎小球腎炎的治療作用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

健康Wistar大鼠60只，雌、雄各半，體重180g～210g，吉林大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK-(吉)2008-0005。

1.2 實驗用藥與試劑

紫花苜蓿提取物(黃色粉末，黃酮類成分含量約為10%，用時以水配成所需濃度。陜西瑞康生物工程有限公司，批號：1007，規(guī)格：10∶1)；腎炎康膠囊(長春新宇制藥有限公司)；弗氏完全佐劑(北京鼎國生物技術有限責任公司)。

1.3 儀器

GF-D800生化分析儀(山東高密彩虹分析儀器有限公司)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用t檢驗。

2 實驗方法

2.1 腎皮質(zhì)弗氏完全佐劑混懸液的制備

取健康Wistar大鼠，脫椎處死，迅速摘取腎臟，用生理鹽水反復沖洗，切開腎臟，取腎皮質(zhì)3g，加生理鹽水，冰浴條件下勻漿，將勻漿液加生理鹽水至60mL，按1∶1比例加入弗氏完全佐劑，制成腎皮質(zhì)弗氏完全佐劑混懸液120mL備用。

2.2 Heyman’n腎小球腎炎模型的復制[1]

選取180g～210g健康Wistar大鼠，雌、雄各半。其中，10只大鼠作為正常對照組，其余大鼠經(jīng)腹腔注射腎皮質(zhì)弗氏完全佐劑混懸液1.5mL/只。大鼠每間隔2周按同樣方法、同劑量注射1次，共注射5次。末次注射后24h，將大鼠放入代謝籠中，收集尿液，雙縮脲法測尿蛋白含量，尿蛋白含量升高(尿蛋白定量>0.25g/L)大鼠為模型成功指標。

2.3 給藥方法及劑量

選成模大鼠40只，按尿蛋白含量和體重分組，分別為模型組、腎炎康膠囊0.46g/kg組、紫花苜蓿提取物高劑量4g/kg組和低劑量2g/kg組，每組10只。正常對照組及模型組給同體積水，受試動物每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥21d，給藥體積均為20mL/kg。

2.4 觀察指標及尿蛋白檢測

分別于成模后(給藥前)、末次給藥后1h將大鼠放入代謝籠內(nèi)收集尿液，雙縮脲法測定尿蛋白含量；尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)檢測：末次給藥后由大鼠腹主動脈取血6mL，2mL自然沉降后，3000r/min離心10min，取上層血清用于檢測；摘取腎臟進行病理組織學檢測。

3 實驗結果

3.1 紫花苜蓿提取物對尿蛋白、尿素氮、肌酐的影響

模型組大鼠尿蛋白含量明顯高于空白對照組，表明腎小球腎炎模型形成。紫花苜蓿提取物連續(xù)給藥21d后，高劑量組尿蛋白含量均明顯低于模型組(P<0.05)，表明紫花苜蓿提取物明顯降低Heyman’n腎炎模型大鼠尿蛋白含量；模型組大鼠尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)同正常對照組比較無統(tǒng)計學意義，表明該指標在本次造模過程中對于血清生化學指標BUN、CRE無明顯影響。結果見表1。

表1紫花苜蓿提取物對慢性腎炎大鼠尿蛋白和血清生化學的影響

Table 1Purple alfalfa extract of chronic nephritis in rats urine protein and the effects of serum biochemistry

注：同模型組比較，*．P<0.05；**．P<0.01。

Note:Compared with model group，*．P<0.05；**．P<0.01．

3.2 紫花苜蓿提取物對Heyman’n腎炎大鼠腎臟病理組織學的影響

肉眼觀察可見，正常對照組大鼠腎臟呈暗紅色，組織新鮮，無異?，F(xiàn)象；模型組大鼠腎臟顏色為黃色，表面粗糙，無血色；紫花苜蓿提取物各劑量組大鼠腎臟顏色呈黃色至暗紅色之間，但顏色較模型組明顯趨于好轉。光學顯微鏡下觀察可見，正常組腎組織結構正常，腎小球在腎皮質(zhì)區(qū)分布較均勻，腎小球囊清晰，基底膜厚度正常，內(nèi)膜細胞排列整齊大小較一致，血管球正常形態(tài)，腎小管形態(tài)正常；模型組腎組織結構大體正常，腎小球在皮質(zhì)區(qū)分布較均勻，部分略增大，腎小球囊內(nèi)可見蛋白樣物質(zhì)紅細胞，腎小球囊上皮細胞可見少數(shù)上皮增生凸起，部分血管球的血管呈擴張狀態(tài)，血管內(nèi)皮細胞略增大(3例較明顯)，腎小管形態(tài)基本正常，管腔內(nèi)可見蛋白樣物質(zhì)，腎間質(zhì)可見白細胞；紫花苜蓿提取物高劑量組腎組織結構大體正常，腎小球在皮質(zhì)區(qū)分布較均勻，部分略增大，腎小球囊內(nèi)可見蛋白樣物質(zhì)(較模型組明顯減少)，腎小球囊上皮細胞與正常對照組基本一致，未見明顯改變，血管球大部分較正常，部分(1例)可見血管擴張，血管內(nèi)皮細胞略增大；紫花苜蓿提取物低劑量組腎組織結構大體正常，腎小球在皮質(zhì)區(qū)分布較均勻，部分略增大，腎小球囊內(nèi)可見蛋白樣物質(zhì)(較模型組減少)，腎小球囊上皮細胞與正常對照組基本一致，未見明顯改變，血管球大部分較正常，其中有2例間質(zhì)中白細胞較多。模型組病理組織學觀察表明，大鼠慢性腎炎模型基本成立；紫花苜蓿提取物各給藥組與模型組比較其病理組織學改變均有不同程度地明顯減輕。表明紫花苜蓿提取物對慢性腎炎大鼠具有治療作用。

4 討論

Heyman’n腎炎的臨床過程和病理類型與人類膜性腎病十分接近，該動物模型分為主動型Heyman’n腎炎和被動型Heyman’n腎炎，該腎炎發(fā)病機制是由于多種細胞因子、補體激活、膜攻擊復合物形成、炎癥細胞以及炎性介質(zhì)增加而引發(fā)一系列炎癥反應，最終導致腎小球基底膜損傷。

本實驗采用的是主動型Heyman’n腎炎模型。實驗結果表明，模型組大鼠經(jīng)腹腔注射腎皮質(zhì)弗氏完全佐劑混懸液5次后尿蛋白含量明顯高于空白對照組，病理組織學可見腎小球囊內(nèi)有蛋白樣物質(zhì)紅細胞，腎小球囊上皮細胞可見少數(shù)上皮增生凸起，部分血管球的血管呈擴張狀態(tài)，血管內(nèi)皮細胞略增大，腎小管形態(tài)基本正常，管腔內(nèi)可見蛋白樣物質(zhì)，腎間質(zhì)可見白細胞，表明Heyman’n大鼠腎炎模型形成。紫花苜蓿提取物給藥21d后，高劑量組、低劑量組可明顯降低大鼠尿蛋白含量，腎臟病理組織學亦可見腎小球囊內(nèi)蛋白樣物質(zhì)較模型組明顯減少，腎小球囊上皮細胞與正常對照組基本一致，未見明顯改變；血管球大部分較正常，部分可見血管擴張，血管內(nèi)皮細胞略增大，提示紫花苜蓿提取物對慢性腎炎大鼠具有治療作用看，同時明顯降低尿蛋白含量。

實驗結果表明，紫花苜蓿提取物對慢性腎炎大鼠腎臟具有保護作用，但慢性腎炎發(fā)病機制極其復雜，其保護作用機制還有待于進一步探討。

[1]徐淑云.藥理實驗方法學[M]北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:1227.