王晗，雷秀娟，宋娟，尹紅新，姚麗娜，梁韶，侯志芳，王英平

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春?130112)

人參(PanaxginsengC.A.Mey)為多年生草本植物，是我國名貴中藥材，具有抗腫瘤、抗衰老等功效。由于人參生長周期長且不能連作，嚴重阻礙了我國人參產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。為此，將組織培養(yǎng)應(yīng)用于人參育種，為縮短育種年限及實現(xiàn)種質(zhì)創(chuàng)新提供了技術(shù)手段。從此，細胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)研究成為該領(lǐng)域的熱點。

由于植物懸浮培養(yǎng)技術(shù)受生長周期、pH、初始接種細胞狀態(tài)、培養(yǎng)基成分等因素的影響，懸浮培養(yǎng)過程中其細胞活力、細胞狀態(tài)對細胞生長和次生代謝產(chǎn)物的合成有重要的作用。從20世紀70年代開始，研究者采用2，3，5-氯化三苯四氮唑(TTC)-脫氫酶還原法測定植物細胞活力[1，2]。TTC-脫氫酶還原法最早應(yīng)用于植物種子活力的測定[3]，后來逐步用于植物根系、莖葉、花粉等部位細胞的活力檢測[4，5]和超低溫保存后細胞相對存活率的測定[6～8]，國內(nèi)不少學(xué)者用于植物懸浮細胞活力的測定[9]。

目前，國內(nèi)報道TTC-脫氫酶還原法以氧化還原性染料TTC作為指示劑，當細胞內(nèi)有生物氧化(脫氫反應(yīng))時，TTC接受H被還原成紅色的三苯基甲月贊(TF)，使用有機溶劑萃取出TF，在485nm波長下測其吸光光度值，以吸光光度值來反映脫氫酶活性，進而反映細胞活力[10，11]。此方法雖然操作簡單，但在實際應(yīng)用中常受多種因素的影響，如溶液pH、萃取劑、反應(yīng)溫度等[12，13]。因此，本試驗采用單因子試驗設(shè)計和正交試驗設(shè)計對人參細胞活力的測定參數(shù)進行優(yōu)化，確定人參細胞TTC-脫氫酶活力測定所需條件，為人參優(yōu)良細胞篩選提供理論依據(jù)，加快人參育種的工作進程。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗供試材料由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所資源圃種植的3年生人參葉片為外植體，建立人參愈傷組織無性系。

1.2 試劑

2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，上?；菔郎噭┯邢薰?；0.9%生理鹽水(四平巨能藥業(yè)有限公司)；磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、無水乙醇、甲醛(分析純，北京化工廠)；硫酸鈉(Na2SO3)、連二亞硫酸鈉(Na2S2O4，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 方法

1.3.1材料的制備將人參葉片誘導(dǎo)而成的愈傷組織繼代培養(yǎng)15d左右，接種于MS液體培養(yǎng)基中，置于搖床上25℃培養(yǎng)10d。樣品于800r/min離心10min，去液體培養(yǎng)基，然后用0.9%生理鹽水沖洗，于800r/min離心10min，去上清，重復(fù)3次，稱取0.1g人參細胞，待用。

1.3.2不同濃度TTC溶液的配制稱取TTC粉末0.05g、0.1g、0.2g、0.4g、0.6g、0.8g、1.0g溶于100mL蒸餾水中，濃度分別為0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，避光保存。

1.3.3不同pH緩沖液的配制分別稱取35.82g Na2HPO4·12H2O和15.6g NaH2PO4·2H2O溶于500mL蒸餾水中，配制濃度為0.2mol/L的NaH2PO4和Na2HPO4溶液；將2溶液按一定比例混合，得到不同pH的磷酸緩沖液。

1.3.4TTC標準曲線制備參考趙連梅方法[14]，稱取0.05g TTC，溶于50mL蒸餾水中，配制1mg/mL TTC標準溶液，存于棕色容量瓶中。分別吸取1mg/mL標準溶液0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL置于50mL棕色容量瓶中，蒸餾水定容，則TTC質(zhì)量濃度分別為0mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L、120mg/L，即為工作液。將此工作液分別吸取1.0mL置于15mL離心管中，再依次加入磷酸緩沖液(pH 7)2mL、0.36% Na2SO3溶液1mL、蒸餾水1mL，混勻后分別加入連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)5mg，充分混勻置于暗處，致使TTC全部還原為TF。加入0.4mL甲醛終止反應(yīng)。再加5mL無水乙醇為萃取劑，60℃水浴20min～30min，離心取上清，于485nm波長處測吸光光度值，繪制標準曲線。

1.3.5TTC法測定細胞活力參照Towill和Mazur方法[15]，取待用0.1g人參細胞置于試管中，加入TTC溶液和磷酸緩沖液5mL(按1∶1比例混合)，靜置于暗處，TTC接受細胞呼吸過程中產(chǎn)生的H被還原為紅色物質(zhì)TF。一段時間后去上清，加入5mL蒸餾水洗滌，重復(fù)2次～3次。加入5mL無水乙醇，置于60℃水浴20min～30min，室溫下靜置至細胞無色。取上清，采用分光光度計在485nm波長處測吸光光度值。根據(jù)測定的吸光光度值計算出TF的質(zhì)量濃度，定義每分鐘每克細胞反應(yīng)1μg TF作為1個酶活力單位。

1.3.6單因子試驗設(shè)計在優(yōu)化TTC-脫氫酶還原法測定人參細胞活力參數(shù)過程中，分別對TTC濃度、pH、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間進行單因子試驗。

1.3.7正交試驗設(shè)計根據(jù)單因素試驗設(shè)計中對TTC濃度、pH、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間進行初步篩選大致范圍，每個因子設(shè)4個水平，用L16(45)正交表作16個試驗(表1)。

表1正交試驗因素與水平

Table 1Factors and levels of orthogonal test

1.3.8數(shù)據(jù)分析以吸光光度值(OD)、酶活力(U)為評價指標，采用SAS統(tǒng)計分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進行極差和方差分析。

2 結(jié)果分析

2.1 TTC法檢測脫氫酶活力的標準曲線

不同濃度的TTC溶液與過量的還原劑Na2S2O4反應(yīng)生成TF，以TF為生成量作為橫坐標、485nm處的吸光光度值為縱坐標作圖，見圖1。

圖1 TF標準曲線

由圖1可得：m(TF)=(OD485+0.0444)/0.0033μg，測定細胞呼吸鏈脫氫酶活力=m(TF)/(t×m)。式中，t：反應(yīng)時間(min)；m：細胞重量(g)。

2.2 單因素試驗設(shè)計

2.2.1TTC濃度對脫氫酶活力的影響TTC作為細胞呼吸過程中產(chǎn)生的H接受體，在樣品反應(yīng)體系中，為了測定不同TTC濃度對TF的生成量的影響。首先將反應(yīng)體系pH設(shè)為7、反應(yīng)溫度為25℃、反應(yīng)時間為24h。試驗中研究了0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0% TTC對脫氫酶活力測定的影響。TTC濃度對脫氫酶活力測定的影響結(jié)果見圖2。

由圖2可知，當TTC濃度為0.05%時，吸光光度值僅為0.1～0.2之間；隨著TTC濃度的增加，吸光光度值、酶活力值呈先上升后下降的趨勢；當TTC濃度為0.6%時，吸光光度值、酶活力值均達到最大；此后脫氫酶活性開始有微小的下降。由此可以得出，試驗中反應(yīng)體系中的TTC濃度控制在0.4%～1.0%之間對獲得穩(wěn)定的TF生成量較有利。

圖2 TTC濃度對TF吸光值和脫氫酶活性測定的影響

2.2.2pH對脫氫酶活力的影響磷酸緩沖液是TTC脫氫酶活性測定常用的緩沖液。首先將反應(yīng)體系中TTC濃度設(shè)為0.6%、反應(yīng)溫度設(shè)為25℃、反應(yīng)時間為24h。試驗中研究了不同pH對脫氫酶活力測定的影響(圖3)。由圖3可知，隨著pH的增大，其吸光光度值、活力值呈先上升后稍微下降的趨勢。當pH為7.5時，吸光光度值、酶活力值均達到最大。因此，反應(yīng)體系中適宜pH控制在7～8中性偏堿范圍內(nèi)。

圖3 pH值對TF吸光值和脫氫酶活性測定的影響

2.2.3反應(yīng)溫度對脫氫酶活力的影響在樣品反應(yīng)體系中，為了測定反應(yīng)溫度對脫氫酶活力的影響，首先將反應(yīng)體系中TTC濃度設(shè)為0.6%、pH設(shè)為7、反應(yīng)時間為24h。本試驗研究了4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃對脫氫酶活力測定的影響。反應(yīng)溫度對脫氫酶活力測定的影響結(jié)果見圖4。

圖4 反應(yīng)溫度對TF吸光值和脫氫酶活性測定的影響

由圖4可知，在其它條件一致的情況下，反應(yīng)溫度對脫氫酶活力影響明顯，隨著反應(yīng)溫度的升高，脫氫酶活力先增加后降低，當反應(yīng)溫度為25℃時，吸光光度值最大；當溫度大于30℃時，吸光光度值急劇下降。因此，對于人參細胞內(nèi)的脫氫酶，適宜的酶促反應(yīng)溫度為25℃～30℃。

2.2.4反應(yīng)時間對脫氫酶活力的影響在樣品反應(yīng)體系中，為了測定反應(yīng)時間對脫氫酶活力的影響，首先將反應(yīng)體系中TTC濃度設(shè)為0.6%、pH設(shè)為7、反應(yīng)溫度為25℃。本試驗研究了3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h、27h對脫氫酶活力測定的影響。反應(yīng)時間對脫氫酶活力測定的影響結(jié)果見圖5。

圖5 反應(yīng)時間對TF吸光值和脫氫酶活性測定的影響

結(jié)果表明，在一定時間內(nèi)，TF的生成量隨著反應(yīng)時間的延長而增大，當反應(yīng)時間為21h，TF生成量最多，吸光光度值最大；隨著反應(yīng)時間延長，吸光光度值反而降低，這與黃春花以蛹蟲草為材料研究TTC-脫氫酶活性[16]時得到的變化規(guī)律一致；反應(yīng)時間為18h時，脫氫酶活性達到最大，這是由于酶活力的大小不僅與TF生成量有關(guān)，也與細胞重量、反應(yīng)時間有關(guān)。

2.3 正交試驗設(shè)計

2.3.1極差分析本試驗采用L16(45)正交試驗設(shè)計，以酶活力值(U)為評價指標，對試驗數(shù)據(jù)進行極差分析(表2)。

表2正交試驗結(jié)果與極差分析

Table 2Results and range analysis of orthogonal test

通過極差分析得出，影響TTC-脫氫酶還原法的主次順序為反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、TTC溶液濃度、pH。

2.3.2方差分析對酶活力值進行進一步方差分析，結(jié)果如表3所示。

結(jié)果表明，在本試驗設(shè)定的4個因素中，反應(yīng)溫度對人參細胞活力影響達到極顯著水平(P<0.01)，反應(yīng)時間對人參細胞活力影響達到顯著水平(P<0.1)，TTC溶液濃度、pH對人參細胞活力影響不顯著。綜上，通過方差分析得出最佳水平組合是ABC3D3，因子A、B可選任意水平，結(jié)合正交試驗，可以選定最佳水平組合為A1B3C3D3。

表3方差分析

Table 3Analysis of variance

注：F0.90(3，3)=5.39；F0.99(3，3)=29.46。

3 結(jié)論與討論

TTC-脫氫酶還原法測定的細胞活力大小反映脫氫酶催化化學(xué)反應(yīng)的能力[17]。影響酶活力的因素有很多，包括溫度、時間、pH、酶濃度等。本試驗對反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、pH、TTC濃度進行單因素試驗和正交試驗，對人參細胞活力測定條件進行優(yōu)化，并對其進行了極差和方差分析。

TTC溶液存在適宜的質(zhì)量濃度范圍，過高或過低均會影響體系TF的生成[18]。Mersi等[19]研究發(fā)現(xiàn)，通過脫氫酶作用產(chǎn)生的H不一定全部傳遞給TTC受體，而且TTC本身的毒性也會抑制酶的活力，進而影響H的傳遞過程，其還原產(chǎn)物TF也可能導(dǎo)致細胞的死亡，這可能是高質(zhì)量濃度TTC溶液導(dǎo)致TF值下降的原因。

酶促反應(yīng)體系的酸度、緩沖容量對酶活力測定影響很大。本研究結(jié)果表示，當pH為7～8時，TF生成量維持在較高水平。由于磷酸鹽緩沖液緩沖范圍相對較窄，但是在一定范圍內(nèi)，人參細胞活力隨著pH的增加而增加，當pH為7.5時，人參細胞脫氫酶活力達到最高，隨后有輕微的下降。因此磷酸緩沖液緩沖范圍適合人參細胞脫氫酶活力的測定。

TTC法測定人參細胞脫氫酶活力檢測的反應(yīng)溫度維持在25℃～30℃。在其他條件一致的情況下，反應(yīng)溫度對脫氫酶活性測定結(jié)果影響明顯，當溫度低于4℃，有少量的TF生成，隨后隨著溫度的升高，TF生成量明顯增加，當溫度為25℃時，吸光光度值和酶活力值均達到最大；當溫度再上升時，脫氫酶反應(yīng)受到影響，吸光光度值急劇下降。其原因可能在于隨著溫度的升高，一方面，酶促反應(yīng)速度加快；另一方面，脫氫酶逐漸變性，導(dǎo)致酶活力降低，當達到酶的極限溫度時，酶促反應(yīng)將不能繼續(xù)進行。

TTC-脫氫酶還原法測定活力時，樣品反應(yīng)體系內(nèi)TF生成量隨反應(yīng)時間的延長而增加[20]。在一定時間內(nèi)，隨著時間的增加，吸光光度值和脫氫酶活力升高，當反應(yīng)時間為18h時，吸光光度值不是最高值，但酶活力值卻達到最高，接著反應(yīng)時間繼續(xù)延長，當反應(yīng)時間為21h，吸光光度值達到最大值，但酶活力值處于下降的趨勢。這是由于酶活力的大小不僅與TF生成量有關(guān)，也與細胞重量、反應(yīng)時間有關(guān)。反應(yīng)時間的再延長并沒有使吸光光度值增加反而使其降低，這可能是由于在氧化還原作用下，破壞了TF的共軛體系[16]。

通過極差和方差分析得出，影響TTC-脫氫酶還原法的主次順序為反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、TTC溶液濃度、pH，反應(yīng)溫度對人參細胞活力影響達到極顯著水平(P<0.01)，反應(yīng)時間對人參細胞活力影響達到顯著水平(P<0.1)。這說明，這兩個試驗因素均是影響TTC-脫氫酶還原法測細胞活力的關(guān)鍵因素。

綜上所述，TTC-脫氫酶還原法測定人參細胞活力的最佳組合為：ABC3D3，由于因子A、B可選任意水平，結(jié)合正交試驗，可以選定最佳水平組合為A1B3C3D3(TTC溶液濃度0.4%、pH 7.5、反應(yīng)溫度25℃、反應(yīng)時間18h)。本試驗優(yōu)化的人參細胞活力檢測方法具有重復(fù)性好、操作方便等優(yōu)點，為人參優(yōu)良細胞篩選、超低溫保存試驗提供可靠的依據(jù)。

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