王晶晶，張澤峰，鄧紅梅，田鈺琪，陳益紅，王春梅

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京?100102)

家蠶起源于我國(guó)，是公認(rèn)的保健和滋補(bǔ)食療珍品[1]，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，家蠶的蠶絲由絲素蛋白和絲膠蛋白2部分組成[2]，蛋白質(zhì)含量高達(dá)98%，富含大量氨基酸，其中甘氨酸和丙氨酸的含量尤其高，因此，它在醫(yī)藥保健方面的作用越來(lái)越受到人們的重視。傳統(tǒng)中藥繭黃是采用家蠶繭殼直接水煮制作而成，藥用效率較低?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)家蠶繭殼進(jìn)行水解處理[3]，得到的水解物具有抗氧化[4]、抗腫瘤[5]、降血糖[6]等作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，家蠶繭殼水解物對(duì)小鼠具有免疫調(diào)節(jié)作用[7]。本試驗(yàn)研究了家蠶繭殼水解物對(duì)細(xì)胞免疫作用的影響及作用方式，為家蠶繭殼水解物免疫調(diào)節(jié)機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑家蠶繭殼水解物(淡黃色粉末，韓國(guó)吾兒得偉有限公司，總氨基酸含量≥89.0%)；抗體芯片試劑盒(RayBiotech公司)；MTT、乙二胺四乙酸(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)；1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；無(wú)支原體胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；異丙醇、鹽酸(北京化工廠)；磷酸鹽緩沖液(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；姬姆薩染液(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司)；TLA、GMAg、ConA、LPS(Sigma公司)。

1.1.2試驗(yàn)動(dòng)物雄性6周齡BALB/c小鼠，SPF級(jí)，體重20g±2g，購(gòu)自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，許可證號(hào)SCXK(京)2011-0004。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及家蠶繭殼水解物灌胃方法

將雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。試驗(yàn)設(shè)50mg/kg、200mg/kg、500mg/kg 3個(gè)劑量組(分別稱低劑量、中劑量、高劑量組)，另設(shè)PBS為溶劑對(duì)照組(CK)。經(jīng)灌胃給予，灌胃量200μL。各試驗(yàn)組均連續(xù)灌胃6周測(cè)定相應(yīng)指標(biāo)。

1.3 小鼠免疫性狀指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[8]的方法，以試驗(yàn)組與空白組OD值(570nm)的差值代表淋巴細(xì)胞增殖能力。

1.3.2血液涂片及白細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)末次給藥后，從每只小鼠的心臟采取500μL的血樣。將部分血樣涂在載玻片上，利用快速染色法染色，用于白細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)。

1.3.3FACS分析小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群比率變化利用“1.3.1”中制備的脾細(xì)胞懸液，每組5×105個(gè)單脾細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀比較脾臟中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的比率。

1.3.4小鼠細(xì)胞因子檢測(cè)利用“1.3.1”中制備的脾細(xì)胞懸液，參考文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行檢測(cè)，利用影像分析器得到影像，然后利用影像分析程序進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 18.0軟件對(duì)所有檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。檢測(cè)數(shù)據(jù)先經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，再進(jìn)行方差分析，如組間差異有顯著性，繼續(xù)進(jìn)行多個(gè)試驗(yàn)組與一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較；對(duì)非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)資料進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足“正態(tài)方差齊”要求后，用轉(zhuǎn)換所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果

2.1 家蠶繭殼水解物對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響

灌胃中劑量家蠶繭殼水解物可極顯著提高小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(P<0.01)，高劑量組也表現(xiàn)出顯著作用(P<0.05)，和對(duì)照組相比，中劑量組提高的量是對(duì)照組的4倍。表明家蠶繭殼水解物具有促進(jìn)正常小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的能力(圖1)。

Compared with the CK,*.showsP<0.05;**.showsP<0.01.The following figure is the same.

Fig.1Effectofsilkcocoonshellhydrolysatesonthelymphocyteproliferationactivityinmice

2.2 白細(xì)胞計(jì)數(shù)

攝取家蠶繭殼水解物的小鼠和CK組小鼠相比，血液中的嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞的比率都出現(xiàn)了明顯的變化，其中，嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的比率下降，單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的比率上升，中劑量組淋巴細(xì)胞比率增加最為明顯(P<0.01，圖2)。

Fig.2Effectofsilkcocoonshellhydrolysatesontherelativequantityoftheleucocytesinmice

2.3 小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群比率變化

對(duì)不同處理的小鼠外周血中T淋巴細(xì)胞中CD4+T和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行分析，與對(duì)照組相比，攝取家蠶繭殼水解物小鼠的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞都有明顯增加(P<0.05)。尤其是中劑量組小鼠CD4+T細(xì)胞數(shù)量增加了12%，CD8+T細(xì)胞的數(shù)量增加了8%(圖3)。

Fig.3EffectofsilkcocoonshellhydrolysatesontheTlymphocytesubsetsofperipheralbloodofmice

2.4 家蠶繭殼水解物對(duì)小鼠分泌細(xì)胞因子的影響

此次檢測(cè)一共跟蹤了22種細(xì)胞因子的變化，分泌最活躍的是IL-6、IL-10、IL-17、MCP-1、IFN-γ 5種細(xì)胞因子，尤其是中劑量組中IL-17、IL-6、IFN-γ的分泌最為活躍，其中IL-17的分泌量是對(duì)照組的4.5倍(圖4)。

圖4 家蠶繭殼水解物對(duì)小鼠分泌細(xì)胞因子的影響

Fig.4Effectofsilkcocoonshellhydrolysatesoncytokinesecretioninmice

3 討論

機(jī)體免疫系統(tǒng)是由非特異性免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫共同構(gòu)成的防御系統(tǒng)，其中，細(xì)胞免疫的增強(qiáng)使得機(jī)體對(duì)抗外部抗原的免疫力增強(qiáng)。T細(xì)胞在細(xì)胞免疫發(fā)揮了重要的作用，當(dāng)外來(lái)抗原入侵機(jī)體細(xì)胞時(shí)，致敏T細(xì)胞及其釋放的細(xì)胞因子協(xié)同作用對(duì)抗抗原。外周淋巴器官或外周血液中的T細(xì)胞分為CD4+和CD8+2個(gè)主要亞群。CD4+T細(xì)胞代表輔助性T細(xì)胞，具有協(xié)助體液免疫和細(xì)胞免疫的功能；CD8+T細(xì)胞通過(guò)直接殺傷作用，主要負(fù)責(zé)對(duì)靶細(xì)胞的清除。檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞的增殖力、T淋巴細(xì)胞亞群比率、細(xì)胞因子分泌量，可反映細(xì)胞免疫的功能[10]。本研究選取了上述3項(xiàng)指標(biāo)和白細(xì)胞總量變化考察了家蠶繭殼水解物對(duì)細(xì)胞免疫的作用。結(jié)果表明，家蠶繭殼水解物能夠增加正常小鼠白細(xì)胞總量，增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞的增殖能力，增加T細(xì)胞中CD4+和CD8+的比率，增加促進(jìn)免疫功能的細(xì)胞因子的分泌。這些結(jié)果說(shuō)明，家蠶繭殼水解物能夠通過(guò)多種方式增強(qiáng)小鼠的細(xì)胞免疫功能。

國(guó)內(nèi)對(duì)蠶絲蛋白功效的研究已有幾十年，日本的研究也證實(shí)了蠶絲蛋白對(duì)人體的營(yíng)養(yǎng)保健功能[11]。有研究報(bào)道，蠶絲蛋白中絲素蛋白的氨基酸構(gòu)成不同于一般食用蛋白質(zhì)，具有護(hù)肝、降壓、防血栓、降血糖等保健作用；絲膠蛋白具有很強(qiáng)的抗氧化活性和對(duì)酪氨酸酶的抑制作用[12]。有文獻(xiàn)表明，在免疫調(diào)節(jié)方面，蠶絲蛋白中大小不同的多肽發(fā)揮了作用[13～15]。本研究中觀察了蠶繭殼水解物灌胃小鼠后的22種細(xì)胞因子變化發(fā)現(xiàn)，IL-17、IL-6、IFN-γ 3種細(xì)胞因子分泌最活躍，這為進(jìn)一步機(jī)制研究提供了思路。在本研究中，所用樣品為多肽和氨基酸的混合物，具體哪些多肽起作用有待進(jìn)一步研究。

[1]胡山林,張娟.蠶絲蛋白在非絹絲領(lǐng)域的研究進(jìn)展[J].北方蠶業(yè),2013,34(1):1-3.

[2]魏兆軍,姜紹通.蠶食用化開(kāi)發(fā)研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2005,26(9):592-596.

[3]羅美琪.絲素肽的酶法制備及其生物活性的研究[D].廣州:華南理工大學(xué),2012.

[4]范金波,任發(fā)政,孫雁,等.絲膠蛋白抗氧化肽的酶法制備及功能評(píng)價(jià)[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué),2009,24(11):279-283.

[5]Chon J W,Lee K G,Yeo J H.Effect of silk fibroin hydrolysate on the apoptosis of MCF-7 human breast cancer cells[J].Int J Indust Entomol,2013,27(2):228-236.

[6]Kato N,Sato S,Yamanaka A,et al.Silk protein,sericin,inhibits lipid peroxidation and tyrosinaseactivity[J].Biosci Biotech Bioch,1998,62(1):145-147.

[7]劉建亭,王玉霞,周曉潮,等.家蠶繭殼水解物對(duì)小鼠免疫功能的影響[J].蠶業(yè)科學(xué),2015,42(1):145-150.

[8]賡迪,胡宇馳,李耀武,等.人工養(yǎng)殖鱷魚(yú)肉提取物增強(qiáng)免疫活性研究[J].首都醫(yī)藥,2010,(10):57-58.

[9]朱丹,張春花,黃慧學(xué),等.蛋白質(zhì)抗體芯片技術(shù)檢測(cè)金黃扶正散對(duì)免疫抑制小鼠細(xì)胞因子的影響[J].廣西醫(yī)科大學(xué)，2012,37(23):3624-3627.

[10]潘華新,徐曉飛,周聯(lián),等.增健口服液配伍營(yíng)養(yǎng)適粉、維康素片對(duì)T細(xì)胞免疫的增強(qiáng)作用[J].現(xiàn)代食品科技，2010,26(4):337-341.

[11]平林潔,陳開(kāi)利.絹絲食品化[J].蠶絲科學(xué)與技術(shù),1991,30(1):42-45.

[12]肖建京,劉明,王云勝,等.蠶業(yè)資源的食用及藥用價(jià)值[J].中國(guó)蠶業(yè),2007,18(3):14.

[13]李加斌.絲蛋白肽對(duì)小鼠免疫功能的影響[D].泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[14]Zhaorigetu S,Yanaka N,Sasaki M,et al.Silk protein，sericin，suppresses DMBA-TPA-induced mouse skin tumorigenesis by reducing oxidative stress,inflammatory responses and endogenous tumor promoter TNF-alpha[J].Oncol Rep,2003,10(3):537-543.

[15]孔祥東.絲素粉的制備及其理化性質(zhì)的研究[D].杭州:浙江大學(xué),2001.