王 戈，任 路，賈連群

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽(yáng) 110847)

電針對(duì)圍絕經(jīng)期抑郁癥大鼠海馬Bcl-2和Bax的影響*

王 戈，任 路△，賈連群

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽(yáng) 110847)

目的:探討“腎腦相濟(jì)”針?lè)▽?duì)圍絕經(jīng)期抑郁癥大鼠海馬Bax和Bcl-2的影響。方法:采用去勢(shì)和慢性不可預(yù)見(jiàn)刺激制備圍絕經(jīng)期抑郁癥大鼠模型，隨機(jī)分為空白組、模型組、藥物組采用鹽酸氯米帕明灌胃，電針組采用電針刺激百會(huì)、腎俞、三陰交穴并比較各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分，采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)大鼠海馬Bcl-2和Bax蛋白含量的變化。結(jié)果:電針和藥物對(duì)圍絕經(jīng)期抑郁癥模型大鼠都具有較好的治療作用，可明顯提高海馬Bcl-2/Bax比率，抑制海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。結(jié)論:海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡與抑郁癥密切相關(guān)，電針可通過(guò)抑制海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡起到抗抑郁作用，腎腦相濟(jì)對(duì)于治療圍絕經(jīng)期抑郁癥有指導(dǎo)作用。

圍絕經(jīng)期;抑郁癥;Bcl;Bax

圍絕經(jīng)期是女性由生殖功能旺盛狀態(tài)向老年衰退的過(guò)渡時(shí)期。《素問(wèn)·上古天真論》曰:“女子七七，任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通?！薄疤旃锝摺贝砼孕韵佥S衰退，生殖機(jī)能喪失［1］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，女性在性激素迅速變化的時(shí)期對(duì)抑郁的易感性增高，激素變化和心理社會(huì)因素使圍絕經(jīng)期成為女性抑郁癥的高發(fā)時(shí)期之一，圍絕經(jīng)期抑郁癥的發(fā)病率占23.8%［2］。近年研究發(fā)現(xiàn)，圍絕經(jīng)期抑郁癥發(fā)病率有逐年增高趨勢(shì)。電針對(duì)抑郁癥有較好的療效，本實(shí)驗(yàn)復(fù)制圍絕經(jīng)期抑郁癥大鼠動(dòng)物模型，采用“腎腦相濟(jì)”電針療法，觀察大鼠行為和海馬Bcl-2和Bax蛋白含量的變化，期望從海馬神經(jīng)元凋亡這一角度探討電針對(duì)圍絕經(jīng)期抑郁癥的治療機(jī)理。

1 材料

1.1 動(dòng)物與分組

17周齡SPF級(jí)雌性SD大鼠40只，體質(zhì)量(240 ±20)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(SCXK(京)2012-0001)提供。按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、藥物組和電針組各10只。

1.2 藥物與試劑

鹽酸氯米帕明片25 mg/片(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn));酶聯(lián)免疫試劑盒(ameko，購(gòu)于上海嵐派生物科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

成都泰盟軟件有限公司OFT-100大小鼠開(kāi)場(chǎng)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng);蘇州醫(yī)療用品廠“華佗牌”針灸針(0.25×25 mm);汕頭市醫(yī)用設(shè)備廠有限公司805-AⅡ型電針儀。

2 方法

2.1 造模方法

圍絕經(jīng)期模型一般選用自然衰老大鼠，其生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，飼養(yǎng)成本高，來(lái)源稀少，相關(guān)的研究報(bào)道相對(duì)較少［3］。去勢(shì)是公認(rèn)的圍絕經(jīng)期造模方法，去勢(shì)大鼠陰道脫落細(xì)胞變化和血清性激素水平與自然圍絕經(jīng)期發(fā)生的改變相似［4-5］。本實(shí)驗(yàn)除空白組外，其余大鼠全部接受雙側(cè)卵巢摘除術(shù)。術(shù)后休養(yǎng)1周，之后連續(xù)5 d對(duì)全部大鼠采集陰道脫落細(xì)胞涂片，除空白組外其余各組大鼠涂片無(wú)周期性變化，說(shuō)明圍絕經(jīng)期模型造模成功。之后全部大鼠接受慢性不可預(yù)見(jiàn)性刺激(UCMS)［6］，刺激持續(xù)21 d，包括夾尾(用止血鉗夾住距大鼠尾尖1 cm處1 min)、冰水游泳(4℃，5 min)、熱應(yīng)激(45℃，5 min)、禁食禁水(24 h)、束縛限制行動(dòng)(1 h)、潮濕墊料并傾斜鼠籠(24 h)和晝夜顛倒(24 h)等7種刺激，每種刺激隨機(jī)出現(xiàn)，相鄰2 d不能給予同樣刺激，每種刺激在21 d中出現(xiàn)不少于3次。

2.2 治療方法

在21 d的造模結(jié)束后，空白組和模型組大鼠正常飼養(yǎng)，藥物組使用鹽酸氯米帕明灌胃。鹽酸氯米帕明是一種三環(huán)類抗抑郁藥，是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中常用的陽(yáng)性對(duì)照藥物，臨床使用有良好的抗抑郁效果。實(shí)驗(yàn)中將藥片碾碎后溶于0.9%生理鹽水中，按20 mg/kg·d-1用量灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃28 d;電針組根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》大鼠穴位定位方法，取“百會(huì)”、“腎俞”和“三陰交”穴。施針后連接電針儀，選用疏密波，頻率2 Hz，通電量以穴位皮膚肌肉輕微抽動(dòng)為準(zhǔn)，留針20 min。電針治療每天1次，連續(xù)治療28 d。

2.3 觀察指標(biāo)與取材方法

2.3.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(Open-Field Test)是測(cè)定抑郁癥大鼠行為學(xué)的經(jīng)典方法［7］，能反映大鼠在新奇環(huán)境中的活動(dòng)度、探究行為、恐懼緊張狀態(tài)及警覺(jué)性。本實(shí)驗(yàn)采用OFT-100大小鼠開(kāi)場(chǎng)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，記錄大鼠在3min內(nèi)總的移動(dòng)距離和在中心區(qū)域停留的時(shí)間。在相同時(shí)間內(nèi)，大鼠移動(dòng)的總距離反映大鼠活躍程度，曠場(chǎng)中心區(qū)域停留的時(shí)間反映大鼠對(duì)于陌生環(huán)境的好奇程度。每只大鼠完成后清理曠場(chǎng)黑箱，避免對(duì)下只大鼠造成影響。上午8∶00-11∶00選在安靜室內(nèi)進(jìn)行，造模開(kāi)始前1 d、造模結(jié)束后1 d和治療結(jié)束后1 d，共測(cè)定3次。

2.3.2 Bcl-2和Bax蛋白含量測(cè)定 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠共死亡6只，模型組在冰水游泳和熱應(yīng)激中各死亡1只，電針組在冰水游泳和禁食禁水中各死亡1只，西藥組在冰水游泳和灌胃中各死亡1只。

第3次曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)完成后，剩余34只大鼠用10%水合氯醛麻醉，剝離大鼠腹主動(dòng)脈使其失血死亡后，剪開(kāi)顱骨冰盒上取腦，分離海馬勻漿，3000 r/ min離心10 min，吸取上清液，－80℃冰箱保存?zhèn)溆?。酶?lián)免疫吸附法(Elisa法)檢測(cè)海馬組織中Bcl-2和Bax含量，試劑的配制和檢測(cè)操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用單因素方差分析進(jìn)行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1顯示，去勢(shì)手術(shù)后慢性不可預(yù)見(jiàn)刺激(UCMS)造模前，各組大鼠之間總移動(dòng)距離的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);造模后模型組大鼠的總移動(dòng)距離明顯低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。經(jīng)過(guò)28 d治療后，電針組和藥物組高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);去勢(shì)手術(shù)后UCMS造模前，各組大鼠中心區(qū)域停留時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);造模后，模型組時(shí)間明顯低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);經(jīng)過(guò)28 d治療后，藥物組和電針組高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)總移動(dòng)距離和中心區(qū)域停留時(shí)間結(jié)果比較(±s)

表1 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)總移動(dòng)距離和中心區(qū)域停留時(shí)間結(jié)果比較(±s)

注:與空白組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

組 別 鼠數(shù) 造模前 造模后 治療后移動(dòng)距離 停留時(shí)間 移動(dòng)距離 停留時(shí)間 移動(dòng)距離 停留時(shí)間空白組 10 4476.20±522.34 8.01±1.41 4193.46±723.738.44±1.58 4521.27±203.15 8.42±1.48模型組 8 4549.28±604.20 7.91±1.89 1352.30±606.241) 4.05±1.031) 1101.22±365.61 4.12±1.18藥物組 8 4446.49±491.36 8.08±1.84 1310.13±411.34 3.96±1.29 3456.18±588.632) 7.52±1.102)電針組 8 4443.62±533.94 8.03±1.72 1278.70±287.98 3.91±1.05 3852.00±405.742) 7.68±0.482)

3.2 海馬中Bcl-2、Bax蛋白含量變化

表2顯示，經(jīng)過(guò)28 d治療后，模型組Bcl-2含量低于空白組，Bax含量高于空白組，Bcl-2/Bax比值低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);電針組Bcl-2含量高于模型組，Bax含量低于模型組，Bcl-2/Bax比值高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。電針組Bcl-2/Bax比值高于藥物組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 各組大鼠海馬中Bcl-2和Bax蛋白含量的比較(±s)

表2 各組大鼠海馬中Bcl-2和Bax蛋白含量的比較(±s)

注:與空白組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05;與藥物組比較:3)P＜0.05

組 別 鼠數(shù)Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax空白組10 50.06±0.68 37.84±0.86 1.32±0.04模型組 8 23.14±0.711) 59.83±0.831) 0.39±0.021)藥物組 8 42.83±0.91 52.76±1.19 0.81±0.03電針組 8 45.28±1.372) 46.41±1.322) 0.98±0.022)3)

4 討論

腦為“元神之府”，抑郁癥等情志疾病的發(fā)病和腦的功能異常有關(guān)。《靈樞·海論》曰:“腦為髓之?！保X主精神意識(shí)思維活動(dòng)功能的物質(zhì)基礎(chǔ)是腦髓。《素問(wèn)·陰陽(yáng)應(yīng)象大論》曰:“腎主骨生髓?！蹦I精不足則腦髓不滿，腦的形態(tài)、功能失常。圍絕經(jīng)期婦女天癸竭，腎精不足、髓?？仗?，導(dǎo)致腦的精神意識(shí)功能失常，出現(xiàn)圍絕經(jīng)期抑郁癥等癥狀［8］。又由于腎病及腦、腦病及腎，所以腦腎失濟(jì)是導(dǎo)致該病的關(guān)鍵。腎俞、三陰交、百會(huì)三穴相合起到補(bǔ)腎益腦、安神解郁的作用。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，腦內(nèi)神經(jīng)元是中醫(yī)所言腦髓的現(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)之一［9］;腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞萎縮和凋亡造成“髓海不足”［10］。海馬是與情感疾病相關(guān)的大腦邊緣系統(tǒng)構(gòu)成組織之一，在學(xué)習(xí)、記憶、情緒、內(nèi)分泌及內(nèi)臟活動(dòng)中起重要作用，也是介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)的重要腦區(qū)。有研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者存在海馬損害，并與海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加有關(guān)［11］。故抑制海馬神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)海馬細(xì)胞增殖已成為抑郁癥的治療目標(biāo)之一［12］。Bcl-2蛋白家族是膜的整合蛋白，根據(jù)功能和結(jié)構(gòu)可分為兩類，一類抑制凋亡，如Bcl-2、Bc1-xL、Bcl-w;一類促進(jìn)凋亡，如Bax、Bak、Bad、Bid。Bcl-2基因及其表達(dá)蛋白可抑制多種組織細(xì)胞的凋亡［13］，能抑制凋亡蛋白活性［14］，對(duì)神經(jīng)元具有類似神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的保護(hù)作用［15］。有研究表明，束縛應(yīng)激大鼠的海馬神經(jīng)元Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)［16］。某些抗抑郁藥物可以通過(guò)抑制海馬組織Bax mRNA的表達(dá)和促進(jìn)Bcl-2 mRNA表達(dá)，進(jìn)而減少海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，達(dá)到治療抑郁癥的作用［17］。Bcl-2/Bax的比例關(guān)系是決定抑制細(xì)胞凋亡作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵［18］。

本實(shí)驗(yàn)采用去勢(shì)造模方法，人為造成雌激素驟然下降模擬圍絕經(jīng)期綜合征的狀態(tài)，該方法周期短、簡(jiǎn)單易行，是公認(rèn)的一種圍絕經(jīng)期綜合征造模方法［5］。經(jīng)過(guò)28 d慢性不可預(yù)見(jiàn)性刺激后，大鼠行為學(xué)檢測(cè)改變、探索能力較差，可判定處于焦慮抑郁狀態(tài)。結(jié)果表明，模型組大鼠海馬中Bcl-2表達(dá)下降，Bax表達(dá)上升，Bcl-2/Bax比例下降，說(shuō)明慢性不可預(yù)見(jiàn)刺激會(huì)造成大鼠海馬細(xì)胞凋亡增多，進(jìn)而導(dǎo)致抑郁狀態(tài)的產(chǎn)生。經(jīng)過(guò)電針和藥物治療之后，Bcl-2表達(dá)上升，Bax表達(dá)下降，Bcl-2/Bax比例升高，說(shuō)明兩者都有抑制海馬細(xì)胞凋亡的作用，且電針的效果要強(qiáng)于鹽酸氯米帕明。這可能是電針治療抑郁癥的作用機(jī)制之一。

本次實(shí)驗(yàn)研究證明，海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡與抑郁癥密切相關(guān)，電針可通過(guò)抑制海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡起到抗抑郁作用，電針及藥物均可以改善大鼠抑郁狀態(tài)。但鹽酸氯米帕明起效慢(往往需要2周以上)，并伴隨諸多不良反應(yīng)，病人依從性較差。而電針與鹽酸氯米帕明療效相當(dāng)，可以發(fā)揮其簡(jiǎn)便廉特點(diǎn)，適合臨床推廣應(yīng)用，尤其“腎腦相濟(jì)”理論指導(dǎo)下的電針療法對(duì)于治療圍絕經(jīng)期抑郁癥具有指導(dǎo)作用。

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R245.9+7

A

1006-3250(2016)06-0838-03

2015-10-07

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81373718)-基于“腎腦相濟(jì)”理論探討電針誘導(dǎo)腦海馬內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞分化治療圍絕經(jīng)期抑郁癥的作用;中醫(yī)“腎精命火”臟象理論相關(guān)疾病與證候的研究(2010CB530401973)

王 戈(1988-)，男，山東青島人，在讀博士，從事針刺機(jī)理的現(xiàn)代研究。

△通訊作者:任 路(1966-)，女，四川巴縣人，教授，博士研究生導(dǎo)師，國(guó)家局學(xué)科帶頭人，從事針灸情志病的臨床與研究，E-mail:renlu2008.student@sina.com。