屈丹，姜雅秋

(1中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，沈陽 110001；2本溪市中心醫(yī)院)

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急性低血糖大鼠血清GLP-1蛋白及下丘腦組織GLP-1R蛋白、mRNA表達變化

屈丹1,2，姜雅秋1

(1中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，沈陽 110001；2本溪市中心醫(yī)院)

摘要：目的觀察急性低血糖大鼠血清胰高血糖素樣肽1(GLP-1)蛋白及下丘腦組織GLP-1受體(GLP-1R)蛋白、mRNA表達變化。方法 Wistar雄性大鼠21只，其中14只大鼠腹腔注射短效胰島素誘導(dǎo)急性低血糖，血糖在2.00～2.64 mmol/L者計為A組(7只)，血糖<2.0 mmol/L者計為B組(7只)；另7只大鼠(C組)不采用任何干預(yù)措施，血糖維持在正常水平。采用ELISA法檢測各組血清GLP-1，Western blotting法和實時熒光定量PCR法分別檢測下丘腦組織GLP-1R蛋白、mRNA。結(jié)果與B組比較，A組下丘腦組織GLP-1R mRNA表達降低；與C組比較，A組血清GLP-1、下丘腦組織GLP-1R mRNA及B組血清GLP-1表達降低，A組下丘腦組織GLP-1R蛋白及B組下丘腦組織GLP-1R蛋白、mRNA表達升高；P均<0.05。結(jié)論 急性低血糖大鼠血清GLP-1蛋白表達降低，下丘腦組織GLP-1R蛋白表達升高，輕度低血糖時GLP-1R mRNA相對表達量下降、重度時升高。

關(guān)鍵詞：低血糖；胰高血糖素樣肽1；胰高血糖素樣肽1受體；動物實驗

機體在應(yīng)激時會為生存做出必須的生物調(diào)整來維持體內(nèi)平衡[1]，包括刺激腦中通路引起下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸和交感神經(jīng)系統(tǒng)(SNS)軸的激活，從而導(dǎo)致一系列神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)。室旁核的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)神經(jīng)元是啟動HPA軸反應(yīng)的重要構(gòu)成。研究[2]發(fā)現(xiàn)，CRH神經(jīng)元的分泌活動直接接受胰高血糖素樣肽1(GLP-1)的調(diào)控，中樞GLP-1能調(diào)節(jié)HPA軸的應(yīng)激反應(yīng)[3～5]。急性低血糖是一種急性應(yīng)激狀態(tài)，在低血糖發(fā)生時下丘腦的“糖感受器”將信息迅速傳遞到相關(guān)神經(jīng)元，引起下丘腦CRH細胞興奮，CRH神經(jīng)元的分泌活動直接接受GLP-1的調(diào)控，GLP-1受體(GLP-1R)同時在下丘腦表達。2013年9月～2015年3月，我們觀察了急性低血糖大鼠血清GLP-1蛋白及下丘腦組織GLP-1R蛋白、mRNA表達變化，旨在探討急性低血糖應(yīng)激時中樞神經(jīng)系統(tǒng)GLP-1R是否參與應(yīng)激調(diào)節(jié)。

1材料與方法

1.1實驗動物與試劑SPF級Wistar雄性大鼠21只，3～8周齡，體質(zhì)量200～220 g，購自北京維通利華實驗動物中心。大鼠GLP-1 ELISA試劑盒購自美國R&D公司(貨號CK-E 30402R)，TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒、GLP-1R及β-actin引物購自大連寶生物公司，GLP-1R一抗購自北京博奧森生物有限公司。

1.2實驗動物分組及短效胰島素干預(yù)21只大鼠分為A、B、C組各7只，A、B組參照文獻[6]方法腹腔注射短效胰島素(生物合成人胰島素，50 U/kg)。以微型血糖儀測量血糖，并記錄所有大鼠腹腔注射胰島素后每隔30 min的血糖值，直至達到目標血糖。A組大鼠血糖2.00～2.64 mmol/L，大鼠興奮，身體發(fā)抖，四處覓食；B組大鼠血糖<2.0 mmol/L，大鼠神志恍惚，甚至全身抽搐。C組大鼠不采用任何干預(yù)措施，血糖維持在正常水平[7]。大鼠稱體質(zhì)量，10%水合氯醛腹腔麻醉，上腹正中切口，游離肋骨，心臟采血，3 000 r/min離心 10 min，分離血清，存入Eppendorf管中，-80 ℃冰箱中保存。大鼠經(jīng)心臟采血后斷頭，3 min內(nèi)取腦，分離腦組織后迅速置于-40 ℃干冰異戊烷中，30 s快速冷凍腦組織，后于-80 ℃冰箱凍存。

1.3大鼠血清GLP-1蛋白檢測采用ELISA法檢測，操作按照試劑盒說明書進行。

1.4大鼠下丘腦組織GLP-1R蛋白檢測采用Western blotting法。組織裂解液裂解下丘腦組織，12 000 r/min離心5 min，取上清，測定總蛋白。已溶解于加樣緩沖液的總蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，100 V電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，脫脂奶粉封閉液封閉2 h，用1∶100稀釋GLP-1R抗體(兔抗鼠多克隆抗體)進行Western 蛋白印跡雜交，40 ℃孵育過夜。1∶400稀釋的二抗孵育2 h，采用DAB顯色試劑盒顯影并檢測，獲得蛋白相對表達定量。GLP-1R蛋白表達以GLP-1R/β-actin灰度值比率來計算。

1.5大鼠下丘腦組織GLP-1R mRNA檢測采用實時熒光定量PCR法。取下丘腦組織50～100 mg，提取總RNA，并進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA，再進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。GLP-1R：5′-CAT CGC TTC AGC CAT CCT TG-3′，5′-CAG CCG TGC TAT ACA TCC ACT TG-3′，162 bp；GAPDH: 5′-TGG TGA AGG TCG GTG TGA AC-3′，5′-CCA TGT AGT TGA GGT CAA TGA AGG-3′，123 bp；反應(yīng)體系25 μL，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s；PCR反應(yīng)條件：95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次；PCR反應(yīng)結(jié)束后，分析DNA擴增曲線，使用專用數(shù)據(jù)處理軟件獲取數(shù)據(jù)，以2-ΔΔCT代表目的基因mRNA的相對表達量。

2結(jié)果

各組大鼠血清GLP-1蛋白及下丘腦組織GLP-1R蛋白、mRNA表達比較見表1。

表1　各組大鼠血清GLP-1蛋白及下丘腦組織GLP-1R蛋白、mRNA表達比較

注：與B組比較，*P<0.05；與C組比較，△P<0.05。

3討論

GLP-1屬于胃腸激素，主要由末端空腸、回腸、結(jié)腸的L細胞分泌，是胰高血糖素原(PPG)基因翻譯表達的產(chǎn)物。葡萄糖、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)均能直接刺激GLP-1的釋放。GLP-1與其受體特異性結(jié)合后，發(fā)揮抑制胰高糖素分泌、促進胰島細胞增殖、抑制胃排空、抑制胃酸分泌等多種生物學(xué)作用[8～11]。也有研究[12]表明，GLP-1在調(diào)節(jié)攝食和體質(zhì)量方面發(fā)揮重要作用，如抑制水的攝入、維持血糖水平、調(diào)節(jié)心率和血壓以及調(diào)節(jié)HPA軸的應(yīng)激反應(yīng)[3～5]。盡管血液循環(huán)中GLP-1不易通過血腦屏障，但這些影響可能通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)的GLP-1神經(jīng)元來調(diào)節(jié)。

GLP-1R分布廣泛，除胰腺和胃腸道外，還分布于肺、腎臟和心臟等全身多個組織和器官，在周圍神經(jīng)系統(tǒng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達豐富[13,14]。Northern雜交試驗表明，GLP-1R在胰島、肺和心臟中的表達量較其他組織高。從胰島、心臟和大腦克隆得到的cDNA片段編譯的氨基酸序列相同，且與GLP-1的親和力相同，表明GLP-1R在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)均具有一定的生物學(xué)功能。另外研究[15]發(fā)現(xiàn)，GLP-1R的表達在不同部位受不同因素的影響。

急性應(yīng)激導(dǎo)致中樞GLP-1、PPG mRNA明顯下調(diào)。慢性應(yīng)激也導(dǎo)致孤束核PPG mRNA和室旁核GLP-1免疫反應(yīng)性下調(diào)。PPG mRNA下調(diào)可以被糖皮質(zhì)激素長短反饋調(diào)節(jié)，這也許是限制應(yīng)激導(dǎo)致的HPA軸工作過度的一種適應(yīng)機制[16]。GLP-1減少與應(yīng)激中止后1～2 h生理不應(yīng)期相一致，阻止了HPA軸過度激活和潛在的有害后果，同樣長期下調(diào)可能限制GLP-1神經(jīng)元重復(fù)激活的影響，可能也是應(yīng)激的一個重要適應(yīng)機制。本研究顯示，A、B組血清GLP-1蛋白表達低于C組，可見急性低血糖應(yīng)激與其他應(yīng)激反應(yīng)相同，此時血清GLP-1也是減少。A、B組下丘腦組織GLP-1R蛋白表達升高，分析其原因考慮為GLP-1需與GLP-1R特異性結(jié)合才能發(fā)揮其生物學(xué)作用，大鼠下丘腦組織GLP-1R蛋白表達雖然升高，但急性應(yīng)激時GLP-1生物利用度減少導(dǎo)致GLP-1激動減少，這種變化也有助于應(yīng)激時HPA軸恢復(fù)。本研究還顯示，與C組比較，A組下丘腦組織GLP-1R mRNA表達降低，B組下丘腦組織GLP-1R mRNA表達升高，這種變化也與應(yīng)激中止后1~2 h生理不應(yīng)期相一致，阻止了HPA軸過度激活和潛在的有害后果。

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(收稿日期:2015-09-23)

中圖分類號：R363.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)03-0028-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.03.010

通信作者：姜雅秋(E-mail： jiangyaqiu@yeah.net)

基金項目：遼寧省重大疾病動物實驗研究及臨床應(yīng)用項目(2012225021)。