周洋，鄒華偉

(中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院，沈陽110022)

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唑來膦酸聯(lián)合培美曲塞對肺腺癌細胞的體外抗腫瘤作用

周洋，鄒華偉

(中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院，沈陽110022)

摘要：目的探討唑來膦酸聯(lián)合細胞毒性藥物培美曲塞是否有協(xié)同抗肺腫瘤作用。方法 將不同濃度(0.1、0.5、1、5、10、50、100 μg/mL)唑來膦酸和不同濃度(0.001、0.01、0.1、1、10、100 μg/mL)培美曲塞以及兩藥聯(lián)合(1、10 μg/mL唑來膦酸+0.01 μg/mL培美曲塞)作用于體外培養(yǎng)的A549肺腺癌細胞株24、48、72 h,采用MTT法檢測細胞生長抑制率,流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。透射電子顯微鏡觀察細胞形態(tài)學改變。結(jié)果唑來膦酸及培美曲塞單藥對A549細胞株生長有抑制作用，呈劑量-時間依賴性(P均<0.05)；唑來膦酸聯(lián)合培美曲塞能夠增強對細胞增殖的抑制作用(P<0.05)。兩藥聯(lián)合用藥時的細胞凋亡率高于單藥(P均<0.05)。結(jié)論 唑來膦酸及培美曲塞對A549細胞株均具有生長抑制及誘導凋亡作用，二者聯(lián)用有協(xié)同抗肺腫瘤作用。

關(guān)鍵詞：肺腫瘤；唑來膦酸；培美曲塞；細胞凋亡

肺癌已經(jīng)成為我國癌癥相關(guān)死亡的首要病因，占所有癌癥死亡的22.7%，到2025年可能會達到100萬[1]。目前，針對肺癌的治療手段主要包括化療、放療和外科手術(shù)治療等。臨床資料顯示，肺癌骨轉(zhuǎn)移占晚期肺癌患者的50%~70%[2]。肺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移后1年生存率為5.3%，2年生存率為2.1%，很少超過3年，是造成肺癌死亡的重要原因[3]。唑來膦酸是第三代含氮的雜環(huán)雙膦酸鹽藥物，是第一個被證實對所有類型惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移均有廣譜療效的雙磷酸鹽藥物[4]。臨床前研究[5]提示，唑來膦酸除了對骨吸收有抑制作用外，還具有直接的體內(nèi)外抗腫瘤作用，可誘導腫瘤細胞凋亡，抑制其增殖和侵襲。研究[6]發(fā)現(xiàn)唑來膦酸可使癌癥患者生存期受益，但其直接抗腫瘤作用及機制尚待進一步的研究闡明。2011年4月～2013年12月，我們進行了唑來膦酸對A549肺腺癌細胞株生長抑制和凋亡作用的體外實驗，并觀察其與培美曲塞聯(lián)用是否具有協(xié)同抗腫瘤作用。

1材料與方法

1.1材料細胞系：人肺腺癌細胞株A549由中國醫(yī)科大學腫瘤研究所惠贈。A549細胞株接種于含10%胎血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置5%CO2、飽和濕度、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁生長，以0.125%的胰蛋白酶消化傳代，每1~2天換液1次。唑來膦酸(商品名擇泰)由瑞士諾華公司饋贈，培美曲塞(商品名力比泰)由美國禮來公司饋贈，四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，RPMI1640細胞培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)購自美國Hyclone公司，凋亡試劑盒(AnnexinV/PI)購自北京寶賽試劑公司，細胞培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司，流式細胞儀購自美國Becton Dickson公司，酶聯(lián)免疫測定儀購自美國BIORAD公司。

1.2細胞生長抑制率的檢測取對數(shù)生長期的A549細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度為每孔1×106/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加液量200 μL。分別加入用去離子水溶解的不同濃度的唑來膦酸：0.1、0.5、1、5、10、50、100 μmol/L以及不同濃度的培美曲塞：0.001、0.01、0.1、1、10、100 μg/mL，不加藥組為空白對照，各設3個復孔。分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后加入MTT試劑(5 mg/mL)20 μL，空白調(diào)零組加入PBS液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸出上清，每孔加DMSO溶液150 μL，置水平搖床上搖15 min。在酶聯(lián)免疫測定儀上選擇波長490 nm，空白孔調(diào)零，測定各孔波長490 mm處的吸光度(A)。計算細胞生長抑制率，抑制率=(1-實驗組A平均值/對照組A平均值)×100%。根據(jù)實驗結(jié)果取唑來膦酸IC50濃度及培美曲塞IC20濃度，用相同方法測定唑來膦酸聯(lián)合培美曲塞作用72 h對肺癌A549細胞的生長抑制率。

1.3細胞凋亡率的測算 采用流式細胞術(shù)。取對數(shù)生長期的A549細胞，以1×106/mL細胞數(shù)接種于培養(yǎng)瓶中，24 h后換液。設對照組(不加藥物，只加入等體積的溶劑)、唑來膦酸組(10 μmol/L)、培美曲塞組(0.01 μg/mL)，以及唑來膦酸(10 μmol/L)+培美曲塞(0.01 μg/mL)組(聯(lián)合組)。每組均重復3瓶。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后收集所有懸浮及貼壁細胞，藥物作用72 h后，收集四組細胞，根據(jù)Annexin V-FITC試劑盒使用說明分離細胞，加入Annexin V-FITC 10 μL混勻，常溫避光反應15 min，再加入300 μL結(jié)合緩沖液以及5 μL PI染料，各組細胞用流式細胞儀分別進行檢測并計算凋亡率。

1.4細胞形態(tài)的觀察取對數(shù)生長期的A549細胞，以1×106/mL細胞數(shù)接種于培養(yǎng)瓶中，24 h后換液。分組及處理同1.3。Hanks液清洗各處理組細胞1次，胰酶消化，用4 ℃離心機收集細胞，用0.1 mmol/L PBS液漂洗兩次；細胞懸浮于2.5%戊二醛中固定30 min，PBS液漂洗兩次；細胞懸浮于1%鋨酸中固定1 h，再用0.1 mmol/L PBS液漂洗兩次；4%醋酸鈾水溶液染色30 min，50%、70%和90%乙醇依次脫水各15 min，100%乙醇脫水20 min，100%丙酮脫水20 min兩次；將細胞置于無水丙酮包埋劑(1∶1)中置換30 min，并振蕩2 h；包埋劑純浸2 h，純包埋劑包埋；并置烘箱內(nèi)聚合，37 ℃中24 h，45 ℃中24 h，60 ℃中48 h。超薄切片(約120 nm)，4%醋酸鈾染色20 min，枸櫞酸鉛染色5 min。高壓80 kV透射電子顯微鏡下觀察和照相。

2結(jié)果

2.1不同濃度唑來膦酸對肺腺癌A549細胞系生長的抑制作用與空白對照比較，不同濃度的唑來膦酸能夠抑制腫瘤細胞生長，且呈時間依賴性及劑量依賴性(P均<0.05)。唑來膦酸對A549細胞作用72 h的IC50值為12.092 μmol/L。見表1。

表1　不同濃度唑來磷酸不同時間對A549細胞

注：與空白對照比較，*P﹤0.05;其余不同時間、不同濃度唑來膦酸之間兩兩比較，P均﹤0.05。

2．2 不同濃度培美曲塞對肺腺癌A549細胞系生長的抑制作用隨著藥物濃度的增加及作用時間的延長，培美曲塞對A549細胞的生長抑制率逐漸增加(P均<0.05)，培美曲塞對A549細胞作用72 h的IC20值為0.098 μg/mL。見表2。

表2　不同濃度培美曲塞不同時間對A549細胞體外生長

注：與空白對照比較，*P﹤0.05；其余不同時間、不同濃度培美曲塞之間兩兩比較，P均﹤0.05。

2.3 唑來膦酸和(或)培美曲塞對A549細胞的生長抑制作用見表3。

表3　唑來磷酸和(或)培美曲塞對A549細胞的

注：與空白對照比較，*P﹤0.05；與相應單藥比較，#P﹤0.05。

2.4各組細胞凋亡率比較唑來膦酸組藥物作用72 h后，細胞凋亡率為17.4%，培美曲塞組細胞凋亡率為29.3%，聯(lián)合組細胞凋亡率為41.7%，聯(lián)合組細胞凋亡率高于唑來膦酸和培美曲塞組(P均<0.05)。

2.5各組細胞形態(tài)學表現(xiàn)對照組細胞形態(tài)大小正常，核膜完整，染色質(zhì)無濃縮、邊聚，細胞器多，胞膜表面皺褶較多；唑來膦酸組、培美曲塞組、聯(lián)合組均呈現(xiàn)凋亡期形態(tài)學改變：胞質(zhì)濃縮、細胞器明顯減少、胞質(zhì)空泡化，胞膜表面皺褶減少、胞膜完整、核型不規(guī)則，染色質(zhì)固縮成塊、聚在核膜周邊或散落在細胞核內(nèi)。

3討論

唑來膦酸治療非小細胞肺癌骨轉(zhuǎn)移可顯著延遲骨相關(guān)事件出現(xiàn)、降低骨相關(guān)事件風險，是惟一被批準用作有效預防或延緩肺癌骨轉(zhuǎn)移(包括溶骨和成骨)骨相關(guān)事件發(fā)生的藥物。其主要作用機制是抑制破骨細胞活性、骨吸收、破骨細胞向腫瘤病變部位的募集和黏附，抑制焦磷酸鹽合成酶，阻止破骨細胞分化、誘導其凋亡[7]。最近的動物實驗與臨床前實驗研究表明，唑來膦酸不僅是一個治療骨轉(zhuǎn)移的藥物，其對乳腺癌、腎癌、肺癌等腫瘤還有直接的抗腫瘤作用[8]。近年研究[9]發(fā)現(xiàn)，唑來膦酸既有影響腫瘤細胞的黏附與入侵、增殖、凋亡的直接作用，又有抗血管生成、對γδT細胞的免疫調(diào)節(jié)作用，抑制甲羥戊酸途徑的間接作用，并能以協(xié)同作用方式增強細胞毒化療藥物的抗腫瘤作用。

本研究結(jié)果表明，唑來膦酸對肺癌A549細胞的生長具有抑制作用，且呈時間和劑量依賴性。流式細胞儀檢測結(jié)果提示唑來膦酸具有誘導肺癌A549細胞凋亡的作用。這種作用在乳腺癌、腎癌、骨肉瘤等細胞株研究中已有報道[10]。就目前所知，唑來膦酸是通過抑制甲羥戊酸途徑中的小GTP酶的異戊烯化，從而影響下游信號的傳導。唑來膦酸抑制Ras基因的法尼基化，阻止其和細胞膜相互作用，下調(diào)Ras信號系統(tǒng)[11]。最近研究發(fā)現(xiàn)，含氮雙磷酸鹽還可以誘導一種獨特的三磷酸腺苷類似物Apppi產(chǎn)生，其可以直接誘導細胞凋亡[12]。另外Mahtani等[13]報道，唑來膦酸對腎癌細胞株的凋亡是依賴Caspase途徑引發(fā)凋亡，但誘導凋亡經(jīng)常不總是伴隨Caspase激活。Aoyagi等[14]在唑來膦酸治療骨肉瘤細胞中發(fā)現(xiàn)了一種新的誘導凋亡機制，不依賴于Caspase的激活，細胞死亡伴隨著Bax增多、Bcl-2表達減少、細胞凋亡誘導因子和核酸內(nèi)切酶G移位 。Li等[15]研究證實，唑來膦酸對肺癌95D細胞的增殖抑制作用是通過細胞凋亡相關(guān)基因ERK、Bcl-2和survivin的表達水平下降，Bax的表達水平增高而實現(xiàn)的。國內(nèi)外研究表明，唑來膦酸對肺癌也可能具有直接的抗腫瘤作用，但確切的機制還有待進一步探討。

化療在肺癌的治療中占重要地位，是肺癌全身治療中最為成熟的方法。有研究[16]結(jié)果提示，盡管新的化療藥物不斷問世，第3代含鉑方案仍不能明顯改善晚期肺癌患者的生存期，中位生存時間為7.4~8.3個月，1年生存率為31%~36%。培美曲塞是一種具有多個作用靶點的新型抗葉酸代謝類藥物，通過抑制嘧啶和嘌呤合成過程中的多種酶，發(fā)揮抑制腫瘤DNA合成的作用，特別是非鱗狀細胞癌非小細胞肺癌(NSCLC)。2004年，培美曲塞被收入ESMO、ASCO、NCCN發(fā)表的NSCLC治療指南，目前已被批準單藥維持治療非鱗狀細胞癌NSCLC，與順鉑聯(lián)用作為晚期非鱗狀細胞癌NSCLC的一線化療藥。本實驗研究結(jié)果顯示，不同濃度的唑來膦酸及培美曲塞均對肺腺癌細胞A549具有明顯的生長抑制作用和誘導凋亡作用，呈劑量和時間依賴性，且唑來膦酸與培美曲塞聯(lián)合組上述作用明顯增強。提示唑來膦酸聯(lián)合細胞毒藥物培美曲塞對A549細胞具有協(xié)同抗腫瘤作用。

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(收稿日期：2015-08-04)

中圖分類號：R734.2

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)01-0035-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.01.012

通信作者：鄒華偉(E-mail:zouhw@sj-hospital.org)