王華偉 王華南 康肖夢 張宇睿 楊福軍 徐文清（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所 天津分子核醫(yī)學(xué)重點實驗室 天津 300192）

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線粒體靶向抗氧化劑MitoQ的抗腫瘤效應(yīng)

王華偉 王華南 康肖夢 張宇睿 楊福軍 徐文清
（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所 天津分子核醫(yī)學(xué)重點實驗室 天津 300192）

摘要采用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測不同濃度MitoQ對肝癌HepG2細(xì)胞的毒性；凋亡誘導(dǎo)實驗研究不同濃度MitoQ對HepG2細(xì)胞凋亡率的影響；裸鼠移植瘤模型研究MitoQ對肝癌HepG2荷瘤小鼠的抑瘤作用。結(jié)果表明，MitoQ對肝癌HepG2細(xì)胞的抑制作用隨著濃度而增加；給藥組凋亡率顯著高于對照組(p<0.01)；MitoQ在1、5、10 mg/kg 劑量給藥10 d后對小鼠的腫瘤生長均有抑制作用，與對照組相比，10 mg/kg劑量組腫瘤體積(p<0.01)和腫瘤質(zhì)量(p<0.05)均有顯著性差異。結(jié)果提示，MitoQ在體內(nèi)體外均具有抑制肝癌HepG2細(xì)胞生長的作用。

關(guān)鍵詞MitoQ，抗腫瘤，HepG2細(xì)胞，細(xì)胞凋亡，線粒體靶向

Supported by Tianjin Research Program of Application Foundation and Advanced Technology(14JCZDJC36400), Beijing Union

Medical College Youth Fund(33320140124), and the Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences

Research Fund(1555)

First author: WANG Huawei, male, was born in September 1988 and graduated from Henan University in 2012. Now he is a master candidate of the Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences

Received 11 September 2015; accepted 08 October 2015

Anti-tumor effects of mitochondria targeted antioxidant MitoQ

WANG Huawei WANG Huanan KANG Xiaomeng ZHANG Yurui YANG Fujun XU Wenqing
(Tianjin Key Laboratory of Molecular Nuclear Medicine, Perking Union Medicine College & Chinese Academy of Medical Sciences, Institute of Radiation Medicine, Tianjin 300192, China)

ABSTRACT MTT was used to detect the cell toxicity of different concentrations of MitoQ on liver cancer HepG2 cells. Apoptosis-inducing assay was used to detect the apoptosis rate on liver cancer HepG2 cells after the treatment with varying MitoQ concentrations. Xenograft tumor model assay was used to investigate the anti-tumor effects of MitoQ on HepG2 hepatocarcinoma-bearing mice. The results showed that the inhibitory effects of MitoQ on HepG2 cells increased with MitoQ concentration, and compared with control group, the administration group apoptosis rate was significantly higher (p<0.01). In nude mice xenograft tumor model assay, the tumor growth was all inhibited after the treatment with 1 mg/kg, 5 mg/kg, and 10 mg/kg MitoQ concentration after 10 d. When the mice were treated with 10 mg/kg MitoQ, tumor volume (p<0.01) and tumor mass (p<0.05) were significantly different from those of the blank group (p<0.01). The results indicate that MitoQ has antitumor effect in vivo and in vitro.

KEYWORDS MitoQ, Auti-tumor, HepG2 cell, Cell apoptosis, Mitochondria targeted

CLC R96

MitoQ是由Murphy和Smith在20世紀(jì)90年代設(shè)計并合成的線粒體靶向抗氧化劑，它由具有抗氧化作用的輔酶Q和具有靶向作用的三苯基膦組成，兩部分通過含10個碳原子的脂肪鏈鏈接（見圖1）[1-2]。大量體內(nèi)體外實驗表明[3-4]，MitoQ可以較容易地滲透通過細(xì)胞膜和線粒體膜，根據(jù)能斯特方程，在正常的生物狀態(tài)下，每61.5 mV的膜電勢親脂陽離子攝入進(jìn)線粒體增加10倍，所以與一般的輔酶Q相比，MitoQ可以在線粒體中大量積累（是原來的100～1000倍），從而達(dá)到保護(hù)線粒體免受氧化應(yīng)激損傷，同時也可調(diào)控癌細(xì)胞的凋亡通道，達(dá)到治療腫瘤的目的。

有文獻(xiàn)報道[2-3, 5]，MitoQ被用于帕金森、局部缺血-再灌注、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥和線粒體疾病等疾病的治療。然而，對于MitoQ的抗腫瘤研究尚未見報道，本研究將對其進(jìn)行初步探索，以期為深入研究提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

MitoQ甲磺酸鹽購自Antipodean制藥公司（質(zhì)量β-環(huán)糊精：質(zhì)量MitoQ甲磺酸鹽=4:1）；氯化鈉注射液購自辰欣藥業(yè)股份有限公司；PBS（Solarbio公司）；MTT （Solarbio公司）；HepG2細(xì)胞本實驗室保存，凋亡試劑盒（eBioscience公司）；雙抗（Solarbio公司）；血清（Gibco公司）；DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Hyclone公司）；胰酶（Gibco公司）；DMSO（Solarbio公司）；賽多利斯電子天平（Sartorius BS124s）；流式細(xì)胞分析儀(美國BD公司)；多功能酶標(biāo)儀（Tecan公司）；臺式低溫高速離心機（Eppendorf公司）；健康SPF級裸鼠，由北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-0004。動物購回后置SPF級動物房籠飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，溫度22～24 ℃，相對濕度50％～60％，壓力差≤10 Pa，光照周期12 h，飼養(yǎng)設(shè)施合格證號：SYXK-(軍)2014-0002。

1.2細(xì)胞毒性實驗

采用MTT法[6]評價MitoQ對HepG2細(xì)胞的毒性。取對數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25％的胰酶消化，含10％胎牛血清的DMEM (Dulbecco's modified eagle medium)培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL，每孔100 μL接種于96孔板中，置于37 ℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，換為含0、5、6.25、10、12.5、20、25、40、50、100 μg/mL MitoQ的新鮮培養(yǎng)基，設(shè)置6個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。終止培養(yǎng)前4 h每孔加入10 μL MTT (5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩混勻10 min，酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm波長測定吸光度(A)值。

腫瘤細(xì)胞存活率(％)=實驗組A值/對照組A值× 100％。

實驗重復(fù)3次，取平均值，計算藥物的IC50。

1.3細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)實驗

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用0.25％胰酶消化，含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，分為5個劑量組，分別接種4×105個細(xì)胞于60 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，在37 ℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用0、5、10、20、25 μg/mL MitoQ處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。2000 r/min離心5 min，用PBS洗兩次，收集5×105個細(xì)胞，加入500 μL的Binding Buffer 重懸細(xì)胞，加入5μL Annexin V-FITC混勻后，避光反應(yīng)10 min，加入5 μL Propidium iodide，混勻，室溫、避光反應(yīng)10 min，0.5 h后在流式細(xì)胞儀上觀察、檢測[7-8]。

1.4體內(nèi)抗腫瘤研究

健康SPF級裸鼠20只，取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，用0.25％胰酶消化，以無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL，取0.2 mL細(xì)胞懸液，接種于正常小鼠左前肢腋窩皮下制備荷瘤模型[9]。待腫瘤長到合適體積，把裸鼠隨機分成4組，分別為生理鹽水對照組、1 mg/kg給藥組、5 mg/kg組、10 mg/kg組，每2 d腹腔給藥一次，每2 d稱量裸鼠的體重并測量瘤塊的體積。按下式計算腫瘤體積和抑瘤率：

腫瘤體積=長度×寬度2/2；

抑瘤率(％)=（1?給藥組腫瘤體積/模型對照組腫瘤體積）×100％[10]。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩組數(shù)據(jù)比較采用兩獨立樣本t檢驗，p<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞毒性實驗

不同濃度的MitoQ處理肝癌HepG2細(xì)胞24 h后對存活率的影響見圖2。

由圖2可知，在0～20 μg/mL濃度范圍內(nèi)，隨著藥物濃度的增加，MitoQ對腫瘤細(xì)胞的生長抑制率逐漸增加；在25～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)，抑制率隨濃度變化不大。說明MitoQ可以在較低的藥物濃度條件下有效地抑制肝癌HepG2細(xì)胞的生長和增殖。20 μg/mL藥物濃度處理肝癌HepG2細(xì)胞24h后對細(xì)胞的抑制率是83.46％。這是由于相比于常規(guī)化療藥物，線粒體靶向藥可以更有效的濃集到作用靶點，更好地發(fā)揮藥物作用，并且可以降低毒副作用。另外，我們通過改良的寇式法計算得到MitoQ的IC50=14.29 μg/mL。

2.2細(xì)胞凋亡實驗

用不同濃度的MitoQ孵育24 h后，用Annexin V-FITC和Propidium Iodide染色，0.5 h后在流式細(xì)胞儀上檢測。圖3顯示，與對照組相比，藥物組能顯著誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡，用濃度為0、5、10、20、25 μg/mL MitoQ處理HepG2細(xì)胞24 h后，凋亡率分別為3.3％、20.7％、22.6％、41.1％、59.0％，其中早期凋亡率分別為0.7％、4.3％、9.5％、10.4％、13.4％。結(jié)果表明，MitoQ可以顯著誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡，并且HepG2細(xì)胞凋亡率與MitoQ的藥物濃度具有量效依從關(guān)系。

2.3體內(nèi)抗腫瘤研究

圖4和表1表明，MitoQ在各劑量給藥10 d后對小鼠的腫瘤生長均有一定的抑制作用，并有量效依從關(guān)系。10 mg/kg 劑量組的抑制作用最強，給藥10 d后解剖裸鼠，解剖前測量腫瘤體積，解剖后稱量瘤塊質(zhì)量，與對照組相比，10 mg/kg組裸鼠腫瘤體積(p<0.01)和腫瘤質(zhì)量(p<0.05)均有顯著性差異。其中，1、5和10 m/kg劑量組對小鼠的抑瘤率分別是15.10％、22.63％和53.13％。體內(nèi)抗腫瘤實驗結(jié)果顯示，MitoQ對裸鼠肝癌HepG2細(xì)胞移植瘤具有顯著的抑制作用，與對照組相比，有顯著性差異。圖4b顯示，給藥組小鼠體重普遍在19 g以上，并且小鼠存活率為100％，說明在給藥劑量范圍內(nèi)MitoQ對小鼠的毒性較小。

表1　不同濃度的MitoQ處理裸鼠10 d后腫瘤體積抑制率和瘤塊質(zhì)量Table 1 Tumor volume inhibitory rates and tumor weights in the xenografts in nude mice treated with varying MitoQ concentration after 10 d (n=5,±s )

表1　不同濃度的MitoQ處理裸鼠10 d后腫瘤體積抑制率和瘤塊質(zhì)量Table 1 Tumor volume inhibitory rates and tumor weights in the xenografts in nude mice treated with varying MitoQ concentration after 10 d (n=5,±s )

注：與對照組比較，* p<0.05。Note: Compared with control group, * p<0.05.

組別Groups腫瘤質(zhì)量Tumor mass / g腫瘤體積抑制率Tumor volume inhibitory rate / ％ Control 1.6380±0.2870 　?1 mg/kg 1.5860±0.2905 0.1510±0.1670 5 mg/kg 1.5740±0.3683 0.2263±0.1241 10 mg/kg 0.9560±0.37700* 0.5310±0.3210

3　討論

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，傳統(tǒng)的化療藥物治療作用有限，并且毒性較大，所以靶向藥逐漸成為發(fā)展的方向。相比于傳統(tǒng)化療藥，靶向藥物具有毒副作用小、針對性強、能克服多藥耐藥性等優(yōu)點。文獻(xiàn)報道，正常細(xì)胞線粒體和癌細(xì)胞線粒體在功能和結(jié)構(gòu)上有較大的區(qū)別[11]，例如，肝癌細(xì)胞與肝臟正常細(xì)胞相比，在大小、形狀、細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)目上均有較大的區(qū)別。觀察發(fā)現(xiàn)，生長較快的腫瘤細(xì)胞比生長較慢的腫瘤細(xì)胞有更少和更小的線粒體，良性腫瘤細(xì)胞含有更多的線粒體和更高水平的氧化酶。基于癌細(xì)胞和正常細(xì)胞線粒體功能和結(jié)構(gòu)的差異性，可以設(shè)計特定的藥物分子，使其與癌細(xì)胞線粒體作用，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。如具有特定生化性質(zhì)的羅丹明123可以選擇性地攝入到癌細(xì)胞線粒體，干擾癌細(xì)胞的代謝，并誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡[12]。同時，癌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能的改變，使其對特定的藥物分子作用更敏感，導(dǎo)致其線粒體釋放凋亡分子。因此，線粒體被認(rèn)為是抗腫瘤藥物研發(fā)過程中一個比較有前途的藥物靶點。

MitoQ是發(fā)展較成熟的線粒體靶向藥物，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種疾病，例如帕金森、線粒體疾病、糖尿病等，但是對其抗腫瘤作用研究較少。經(jīng)過前期的文獻(xiàn)調(diào)研和理論基礎(chǔ)，我們認(rèn)為MitoQ具有潛在的抗腫瘤作用。通過體內(nèi)體外實驗表明，MitoQ具有一定的抗腫瘤作用。文獻(xiàn)報道[4]，小鼠靜脈注射給藥，20 mg/kg沒有毒性，27 mg/kg有明顯的藥物毒性。經(jīng)過我們預(yù)實驗摸索，設(shè)定1、5、10 mg/kg 3個藥物劑量組研究MitoQ在體內(nèi)的抗腫瘤效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，MitoQ在1、5、10 m/kg 劑量給藥10 d后，對小鼠的腫瘤生長均有抑制作用，其中10 m/kg劑量組抑制作用最強。體外實驗結(jié)果表明，藥物在25 μg/mL時，對癌細(xì)胞的生長和增殖能力有較強的抑制作用。

線粒體是真核細(xì)胞的能量代謝中心，遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究表明，線粒體在生理功能的內(nèi)穩(wěn)態(tài)包括電子傳遞、凋亡調(diào)節(jié)和鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要的作用，這些生理功能對身體來說至關(guān)重要，因此這些功能障礙會引起許多疾病，如糖尿病、癌癥及遺傳線粒體疾病分別是由能量轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的功能障礙、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的缺失以及線粒體DNA (mtDNA)的突變引起的[13]。在正常細(xì)胞中，線粒體在鈣穩(wěn)態(tài)/鈣攝入、ATP的產(chǎn)生、脂質(zhì)的代謝中扮演著重要的角色，同時，線粒體內(nèi)也包含大量的致命分子，當(dāng)這些分子從線粒體釋放到胞質(zhì)中，會引起宿主細(xì)胞的死亡[12]，如細(xì)胞色素c、Smac蛋白、IAP等。其中，細(xì)胞色素c是第一個被鑒定的線粒體細(xì)胞凋亡分子，在正常細(xì)胞中細(xì)胞色素c位于線粒體內(nèi)、外膜之間；當(dāng)細(xì)胞被誘導(dǎo)凋亡時，細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)中與Apaf-1結(jié)合形成Apaf-1/cytc復(fù)合物。正常情況下，Apaf-1與ATP/dATP的結(jié)合能力較弱，一旦Apaf-1和細(xì)胞色素c結(jié)合，Apaf-1與ATP/dATP的結(jié)合能力至少提高10倍。Apaf-1/cytc復(fù)合物與ATP/dATP的結(jié)合激發(fā)其多聚化從而形成凋亡體，繼而激活Casepase9和其下游的Casepase3，引起細(xì)胞凋亡[14-15]。由于線粒體在能量代謝和細(xì)胞凋亡中扮演著重要的角色，它被認(rèn)為是抗腫瘤藥發(fā)展的潛在靶點，近年來被越來越多的研究者關(guān)注[12]。近年來，對于線粒體靶向藥物抑制腫瘤細(xì)胞生長的機制研究越來越多，其中Cheng 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，線粒體靶向藥物可以介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的能量代謝，降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生，從而抑制腫瘤細(xì)胞增值。Zhou等[17-18]研究表明，線粒體靶向藥物抑制腫瘤生長是通過調(diào)控線粒體凋亡通路。線粒體靶向藥物使細(xì)胞色素c從線粒體內(nèi)、外膜之間釋放到細(xì)胞質(zhì)，引起Caspase9和下游的Caspase3的激活，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡[17-18]。同時，細(xì)胞色素c的釋放，使電子鏈的傳遞中斷，ATP的合成受阻，線粒體不能維持正常的膜電位。MitoQ抑制腫瘤細(xì)胞生長的機制還有待進(jìn)一步研究。

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Corresponding author:XU Wenqing, professor, master tutor, E-mail: xuwenqing@irm-cams.ac.cn

收稿日期：初稿2015-09-11；修回2015-10-08

通訊作者：徐文清，研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail: xuwenqing@irm-cams.ac.cn

DOI:10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.010201

中圖分類號R96

基金資助：天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)(14JCZDJC36400)、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院青年基金(33320140124)和中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所探索基金(1555)資助

第一作者：王華偉，男，1988年9月出生，2012年畢業(yè)于河南大學(xué)，現(xiàn)為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所碩士研究生