謝麗華 張曉紅 胡曉丹 陳 峰 張澤群 李 群 張海黔（南京航空航天大學(xué) 南京 210016）

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血清鐵生物劑量計(jì)的可行性研究

謝麗華 張曉紅 胡曉丹 陳 峰 張澤群 李 群 張海黔
（南京航空航天大學(xué) 南京 210016）

摘要研究人體外周血血清經(jīng)急性γ射線照射后血清鐵的濃度變化，探討其作為生物劑量計(jì)的可行性。人體血清經(jīng)不同劑量γ射線輻照，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (Enzymes linked immunosorbent assay, ELISA) 法定量檢測(cè)血清鐵的濃度，建立血清鐵濃度與吸收劑量之間的劑量?效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果顯示，血清鐵濃度隨吸收劑量升高，血清鐵濃度與吸收劑量成線性平方關(guān)系：男性[y=30 676.5+2 383.5x–202.7x2(r=0.99)]；女性 [y=26 974.4+ 1 611.8x–141.3x2(r=0.98)]。4 Gy劑量時(shí)間?效應(yīng)關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)離體血清鐵在2 d內(nèi)維持穩(wěn)定。利用建立的線性平方劑量?效應(yīng)曲線估算的吸收劑量與雙盲劑量(1、2、4 Gy)接近，估算值的95％置信區(qū)間較窄。研究結(jié)果提示血清鐵具有重建人體吸收劑量的潛能。

關(guān)鍵詞生物劑量計(jì)，血清鐵，γ射線

(BK20131355)和江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目資助

第一作者：謝麗華，女，1989年2月出生，2013年畢業(yè)于南華大學(xué)，現(xiàn)為南京航空航天大學(xué)在讀碩士研究生，從事生物劑量計(jì)研究

Supported by National Defense Basic Scientific Research Project (B252013307), National Nature Science Foundation of China (11575086, 31400721), Nature Science Foundation of Jiangsu Province (BK20131355) and Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions

First author: XIE Lihua, female, was born in February 1989 and graduated from University of South China in 2013. Now she is a master candidate of Nanjing University of Aeronautics and Astronautics, majoring in biological dosimeter

Received 27 September 2015, accepted 10 November 2015

Development of a new biodosimetry of serum iron

XIE Lihua ZHANG Xiaohong HU Xiaodan CHEN Feng ZHANG Zequn LI Qun ZHANG Haiqian
(Nanjing University of Aeronautics & Astronautics, Nanjing 210016, China)

ABSTRACT The aim is to study the serum iron changes in vitro serum of human peripheral blood irradiated by Co-60 γ-rays and explore its feasibility as a biodosimetry. To establish the dose-response relationship, the concentration of serum iron in γ-rays irradiated serum was detected using ELISA (Enzymes linked immunosorbent assay). The results demonstrated that serum iron level increased with absorbed dose, and the dose-response curve of serum iron concentration followed the linear-quadratic model: male [y=30 676.5+2 383.5x–202.7x2(r=0.99)], female [y=26 974.4+ 1 611.8x–141.3x2(r=0.98)]. Time-response relationship of 4 Gy demonstrated that the serum iron was stable within 2 d. With the dose-response linear-quadratic curve, the absorbed dose was close to the double-blind dose (1, 2 and 4 Gy), and the 95％ confidence interval of the estimated value was narrow. Therefore, the serum iron has the potential to be a new biodosimetry to reconstruct human exposure dose.

KEYWORDS Biological dosimeter, Serum iron, γ-rays

CLC Q691, TL72

生物劑量計(jì)是通過分析和檢測(cè)人體生物材料（如組織、細(xì)胞、DNA、蛋白質(zhì)等）在電離輻射后發(fā)生的某個(gè)方面的改變，利用這種改變建立劑量?效應(yīng)關(guān)系，并通過這種量效關(guān)系來刻度、分析和評(píng)估生物吸收劑量的一類生物標(biāo)志物或相關(guān)分析方法[1]。由于其忠實(shí)性和可重復(fù)性，生物劑量計(jì)在突發(fā)性核事故和放射性事故傷員的分類和救治過程中的作用非常重要[2]。1962年Bender等[3]用離體照射人體外周血淋巴細(xì)胞的方法，首次肯定人體細(xì)胞染色體畸變量和受照劑量呈正比。目前，國(guó)內(nèi)外常用的生物劑量計(jì)主要有染色體畸變(Chromosome aberration, CA)分析、微核(Micronucleus, MN)分析、早熟凝集染色體(Premature condensation chromosome, PCC)分析和染色體熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)分析等。但是這些指標(biāo)和方法在運(yùn)用過程中存在著分析費(fèi)時(shí)、技術(shù)操作人員要求高、指示劑量范圍有限等缺陷。為克服上述不足，人們一方面對(duì)傳統(tǒng)生物劑量計(jì)指標(biāo)及分析技術(shù)加以改造，另一方面也在努力尋找更理想的生物劑量計(jì)指標(biāo)和更為快捷穩(wěn)定的檢測(cè)技術(shù)。最近較受關(guān)注的有單細(xì)胞凝膠電泳、GADD 45基因表達(dá)、線粒體DNA突變及細(xì)胞凋亡檢測(cè)等[4]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，電離輻射可引起機(jī)體微量元素含量的顯著改變[5-6]。放射性作業(yè)人員及事故人員血清中微量元素的變化也有報(bào)道[7-9]。Pulatova等[10]揭示轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵可以作為機(jī)體輻射抗性的生物標(biāo)志物。但到目前為止，尚未有人對(duì)基于電離輻射誘發(fā)大量自由基導(dǎo)致血清中微量金屬元素價(jià)態(tài)變化進(jìn)行研究。鐵是人體中含量最多的微量元素[11]，以二價(jià)鐵(Fe2+)和三價(jià)鐵(Fe3+)兩種離子狀態(tài)存在于機(jī)體。血清中的鐵元素主要為三價(jià)鐵，一般稱之為血清鐵(Serum iron, SI)。人體質(zhì)量的70％由水組成，水輻射分解可產(chǎn)生大量的自由基[12]。自由基與血清中鐵元素相互作用很有可能使鐵的價(jià)態(tài)發(fā)生變化；銅藍(lán)蛋白是一種含銅的亞鐵氧化酶，有研究發(fā)現(xiàn)γ射線可以使血清銅藍(lán)蛋白活性隨劑量增強(qiáng)，并將Fe2+氧化為Fe3+[13]，進(jìn)而導(dǎo)致血清鐵含量升高。本研究組先前研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)γ射線輻照的小鼠血清中二價(jià)鐵含量顯著下降（受照組(0.188±0.030 9) mg/L；未受照組(0.782±0.033 5) mg/L），血清鐵含量升高且與吸收劑量存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系[14]。因此，本實(shí)驗(yàn)擬采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzymes linked immunosorbent assay, ELISA)[15]法檢測(cè)電離輻射后人體血清三價(jià)鐵濃度的變化，并建立血清鐵濃度與吸收劑量的劑量?效應(yīng)曲線，進(jìn)一步探討人體血清鐵作為生物劑量計(jì)的可行性。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器

人血清鐵ELISA試劑盒，中國(guó)上海逸晗生物科技有限公司；酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2血樣采集與處理

選取成年健康的女性和男性各5名，無煙酒嗜好、無急慢性疾病、無毒物接觸史的非放射性工作者。10名志愿者抽取外周血，收集至EP管中靜置30 min，置于水平離心機(jī)3 000 r/min，離心30 min，取上層血清待輻照、ELISA檢測(cè)。10名志愿者血清樣本用于劑量?效應(yīng)關(guān)系研究，同時(shí)從這10名志愿者中任意選2名男性和2名女性的血清樣本用于時(shí)間?效應(yīng)關(guān)系研究和劑量重建。各樣品均用經(jīng)過10％ HCl溶液浸泡、蒸餾水充分淋洗的EP管收集。血清樣本用EP管收集后放入自封袋中，實(shí)驗(yàn)期間受照及未受照樣本均在室溫下。時(shí)間?效應(yīng)關(guān)系研究中，將對(duì)照組、4 Gy受照組一同置于–20℃冰箱保存，且每個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)各封存3個(gè)血清樣品。

1.3照射條件

Co-60放射源為成都中核高通同位素股份有限公司生產(chǎn)，活度為7.4×1011Bq。在劑量?效應(yīng)關(guān)系研究中，吸收劑量分別設(shè)定為0、1、2、4、6和8 Gy。時(shí)間?效應(yīng)關(guān)系研究中的吸收劑量為4 Gy，對(duì)照組為0 Gy。在劑量重建中，設(shè)定雙盲劑量1、2和4 Gy。劑量率為0.20 Gy/min。

1.4ELISA檢測(cè)血清鐵

ELISA檢測(cè)步驟如下：第1步，設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，將50 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入到標(biāo)準(zhǔn)品孔，樣本孔中先加40 μL樣本稀釋液再加10 μL的待測(cè)樣本，空白孔不加任何試劑、樣品；第2步，在標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，封板膜封住反應(yīng)孔，恒溫箱溫育60 min；第3步，手工洗板，甩盡孔內(nèi)反應(yīng)液，各孔加入400 μL洗滌液洗滌，重復(fù)洗滌5次；第4步，各孔先加入50 μL底物A（過氧化氫）再加入50 μL底物B（TMB鹽酸鹽），37℃避光孵育15 min；第5步，各孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)在酶標(biāo)儀上讀取450 nm處吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的已知濃度和檢測(cè)的吸光度值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)品曲線確定未知樣品的血清鐵濃度。各樣本均做5個(gè)復(fù)孔。

1.5雙盲法重建劑量

一名實(shí)驗(yàn)人員將雙盲組血清進(jìn)行一定劑量的γ射線照射。另一名實(shí)驗(yàn)人員在不知吸收劑量的前提下，照后立即采用ELISA 法檢測(cè)雙盲組血清鐵濃度，并根據(jù)既定劑量?效應(yīng)關(guān)系曲線估算吸收劑量。

2　結(jié)果與討論

2.1γ射線輻照離體血清后血清鐵劑量?效應(yīng)關(guān)系

表1為劑量?關(guān)系效應(yīng)研究中，10名志愿者離體血清γ射線輻照后血清鐵濃度的變化，檢測(cè)時(shí)間為血清輻照后30 min。由于正常人體男性(14.30～32.20 μmol/L)和女性(10.70～28.60 μmol/L)[16]血清鐵濃度范圍有明顯差異，所以我們對(duì)輻照后男性與女性的血清鐵濃度分別進(jìn)行研究。表1是5名男性和5名女性的平均結(jié)果，以±s表示。數(shù)據(jù)顯示，男性和女性對(duì)照組血清鐵濃度均在正常值范圍內(nèi)。在0～6 Gy劑量范圍內(nèi)，血清經(jīng)γ射線照射后血清鐵的濃度隨吸收劑量增大而升高，血清鐵升高是吸收劑量依賴的。當(dāng)劑量升至8 Gy時(shí)樣品中血清鐵濃度不再升高，且與6 Gy劑量輻照樣品血清鐵濃度無顯著差異(p>0.05)。這是因?yàn)殡x體后血清中鐵離子的含量是一定的，當(dāng)吸收劑量達(dá)到6 Gy以后血清中Fe3+含量飽和了。對(duì)男性、女性兩組血清鐵濃度分別進(jìn)行單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)不同劑量(0、1、2、4、6、8 Gy)輻照血清鐵濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

由于8 Gy與6 Gy劑量輻照后的血清中血清鐵濃度無差異，因此現(xiàn)將0～6 Gy劑量范圍內(nèi)血清鐵濃度進(jìn)行劑量?效應(yīng)關(guān)系擬合。圖1是男性、女性血清鐵濃度隨劑量（0、1、2、4 和6 Gy）變化的線性平方劑量?效應(yīng)關(guān)系曲線。

表1　不同劑量γ射線輻照人體外周血血清鐵的變化Table 1 Changes of SI in vitro serum irradiated with different does of Co-60 γ-rays

二次多項(xiàng)式方程為：男性y=30676.5+2 383.5x–202.7x2(r=0.99)；女性y=26 974.4+1 611.8x –141.3x2(r=0.98)。表明在0～6 Gy血清中Fe3+含量升高與吸收劑量有很好的相關(guān)性。先前研究發(fā)現(xiàn)小鼠血清鐵濃度在0～7 Gy 范圍內(nèi)與劑量成線性關(guān)系，線性方程為y=0.98x+6.76 (r=0.98)[14]，這與本研究結(jié)果存在差異。我們推測(cè)存在這種差異的原因是：小鼠與人類的種屬差異；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)血清是在體照射而本實(shí)驗(yàn)是人血清離體照射。

2.2γ射線輻照血清鐵變化的時(shí)間?效應(yīng)關(guān)系人體血清對(duì)照組和4 Gy受照組樣品照后立即放入–20 ℃冰箱保存。在保存后的不同時(shí)間點(diǎn)分別檢測(cè)兩組樣本的血清鐵濃度，圖2是男性、女性血清鐵時(shí)間?效應(yīng)曲線圖。由圖2a男性血清鐵濃度隨保存時(shí)間變化可知，與未受照組比較4 Gy受照組在1 d和7 d血清鐵濃度均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001)，而照后14～30 d則沒有差異；對(duì)未照射對(duì)照組血清保存0～30 d血清鐵濃度改變進(jìn)行單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)血清保存1 d與從人體取出立即檢測(cè)（圖中標(biāo)注的0 d）相比，血清鐵濃度升高差異不顯著(p>0.05)。但與0 d的血清鐵濃度相比，保存7～30 d樣本的血清鐵濃度顯著升高(p<0.001)。圖2b女性血清鐵變化趨勢(shì)與男性血清鐵變化情況基本一致。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，血清置于–20℃冰箱保存時(shí)其保存環(huán)境在1～2 d內(nèi)對(duì)血清鐵含量并無顯著影響；人體血清經(jīng)4 Gy γ射線照射血清鐵含量升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

由于樣品未經(jīng)密封保存在–20℃冰箱會(huì)導(dǎo)致樣本的體積發(fā)生變化，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)空氣中的氧氣繼續(xù)將血清中Fe2+氧化為Fe3+。從而使血清鐵濃度在0～14 d持續(xù)上升，但是血清中的鐵離子含量是一定的，所以在保存的14～30 d血清鐵的濃度不再上升。雖然穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)一個(gè)生物劑量計(jì)的重要指標(biāo)，由于實(shí)驗(yàn)條件的限制不能將正常人體進(jìn)行γ照射研究血清鐵的穩(wěn)定性，但是前階段輻照后小鼠血清鐵升高的研究結(jié)果顯示4 Gy輻照小鼠異常的高水平血清鐵含量一直維持到照后21 d。另外結(jié)合對(duì)照組與4 Gy受照組及對(duì)照組0 d與保存1～30 d內(nèi)血清鐵濃度的分析，可以進(jìn)一步得出除其他原因外，γ射線能使血清鐵濃度升高是顯著的。這一點(diǎn)從各劑量組照后立即檢測(cè)的血清鐵濃度（0 d血清鐵濃度）顯著高于對(duì)照組可以看出。其次，對(duì)照組保存1 d血清鐵濃度與0 d血清鐵濃度比較沒有顯著差異，說明血清鐵濃度檢測(cè)在一定照后時(shí)間具有作為評(píng)估受照劑量的潛力。鑒于血清保存從第7 天開始，對(duì)照組血清鐵濃度顯著高于采血當(dāng)天(0 d)的檢測(cè)濃度，我們建議使用血清鐵作為生物劑量計(jì)指標(biāo)應(yīng)在收集血清后2 d內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

2.3劑量評(píng)估

采用雙盲法測(cè)量人離體血清照后30 min血清鐵濃度并根據(jù)上述所得的劑量?效應(yīng)關(guān)系方程對(duì)其受照劑量進(jìn)行重建。雙盲劑量分別為1、2和4 Gy。人離體血清鐵濃度的測(cè)量值以及根據(jù)上述劑量?效應(yīng)曲線所估的吸收劑量列于表2。由表2可知，重建劑量與雙盲劑量接近。其中，1 Gy雙盲劑量照射評(píng)估值的95％置信區(qū)間為：男性0.93～1.07 Gy，女性0.77～1.12 Gy；2 Gy雙盲劑量照射評(píng)估值的95％置信區(qū)間為：男性1.92～2.11 Gy，女性1.81～2.06 Gy；4 Gy雙盲劑量照射評(píng)估值的95％置信區(qū)間為：男性3.75～4.14 Gy，女性3.91～4.20 Gy。

3　結(jié)論

在前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了人體血清鐵作為生物劑量計(jì)的可行性。得到血清鐵濃度劑量?效應(yīng)曲線，通過采用雙盲法進(jìn)行劑量重建，發(fā)現(xiàn)根據(jù)已得到的劑量?效應(yīng)關(guān)系曲線評(píng)估吸收劑量與雙盲劑量接近，置信區(qū)間較窄，說明血清鐵能夠準(zhǔn)確地估算吸收劑量。酶聯(lián)免疫試驗(yàn)法，檢測(cè)方法可靠、簡(jiǎn)單、普遍，從收集樣本到獲得結(jié)果，僅需3～4 h，操作要求簡(jiǎn)單，滿足了生物劑量計(jì)快速、高通量檢測(cè)的需求。因而血清鐵具有廣泛用于核事故重建吸收劑量的前景。但值得注意的是，與所有的檢測(cè)手段一樣，基于血清鐵濃度檢測(cè)的估算方法也有其局限性，比如血清鐵濃度會(huì)受機(jī)體鐵代謝的情況影響，因此受照人員若是貧血、腫瘤患者、血色素沉著病患者以及孕婦等，都不適合用血清鐵濃度變化進(jìn)行劑量估算。事實(shí)上，目前還沒有一個(gè)足夠理想的生物劑量指標(biāo)。大多生物劑量計(jì)在實(shí)際應(yīng)用中需要不斷的優(yōu)化。尋找更為理想的生物劑量計(jì)指標(biāo)及更為快捷的檢測(cè)技術(shù)一直是輻射安全領(lǐng)域研究人員的主要方向。

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Corresponding author:Ph.D. ZHANG Haiqian, professor, E-mail: zhanghq@nuaa.edu.cn

收稿日期：初稿2015-09-27；修回2015-11-10

通訊作者：張海黔，博士，教授，E-mail: zhanghq@nuaa.edu.cn

DOI:10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.010501

中圖分類號(hào)Q691，TL72

基金資助：國(guó)防基礎(chǔ)科學(xué)研究項(xiàng)目(B2520133007)、國(guó)家自然科學(xué)基金(11575086, 31400721)、江蘇省自然科學(xué)基金