常 誠沈麗萍張學清李 琳李孝鑫王治東周平坤

1（南華大學公共衛(wèi)生學院 衡陽 421000）

2（軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所 北京 100850）

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輻射誘導分子lnc-RI穩(wěn)定敲低細胞系建立及其功能

常 誠1,2沈麗萍2張學清2李 琳2李孝鑫2王治東2周平坤1,2

1（南華大學公共衛(wèi)生學院 衡陽 421000）

2（軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所 北京 100850）

摘要制備lnc-RI干涉表達的慢病毒顆粒，建立lnc-RI穩(wěn)定下調的HeLa細胞系，探索lnc-RI對細胞輻射敏感性的作用。首先將lnc-RI特異性干涉序列插入干涉表達載體pGLV2中，并制備慢病毒顆粒；然后，將慢病毒顆粒感染HeLa細胞，建立lnc-RI穩(wěn)定下調的細胞系，并通過RT-PCR檢測不同干涉序列對lnc-RI表達的干涉效果；最后，通過平板克隆形成實驗分析lnc-RI表達下調對HeLa細胞放射敏感性的影響。結果顯示，成功制備了攜帶lnc-RI干涉序列的慢病毒顆粒，并成功感染HeLa細胞，通過RT-PCR實驗鑒定獲得兩株lnc-RI穩(wěn)定敲低細胞系?？寺⌒纬蓪嶒灠l(fā)現，與對照相比，lnc-RI敲低的HeLa細胞系的放射敏感性增加。因此，初步證實lnc-RI表達下調增加HeLa細胞放射敏感性。

關鍵詞長鏈非編碼RNA，lnc-RI，慢病毒，RNA干涉，電離輻射

wangzhidong1977@126.com

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81573083 and 81402631)

First author: CHANG Cheng, female, was born in June 1987 and graduated from North China University of Science and Technology in 2012. Now she is a master candidate of University of South China, majoring in public health and preventive medicine and focusing on health toxicology. E-mail: 1109308002@qq.com

professor, E-mail: wangzhidong1977@126.com

Received 17 September 2015; accepted 20 October 2015

Establishment of stable knock-down cell lines and function study of lnc-RI, a radiation-induced gene

CHANG Cheng1,2SHEN Liping2ZHANG Xueqing2LI Lin2LI Xiaoxin2WANG Zhidong2ZHOU Pingkun1,2

1(College of Public Health, University of South China, Hengyang 421000, China)
2(Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China)

ABSTRACT To prepare the lentivirus granules interfering lnc-RI and establish HeLa cell lines consistently down-regulating lnc-RI, as well as discover its effects on radiation damage, the lentivirus granules bearing various interfering sequences were prepared by lnc-RI carrying specific interfering sequences in to interfering plasmid pGLV2. The estable cell lines were established after infecting HeLa cells with lentivirus granules. RT-PCR was employed to determine the inhibitory effects of various interfering sequences on lnc-RI expression. DNA damage of the established estable cell lines were induced by ionizing radiation sensitivity of the established cell lines which weredetermined by colony formation assay. The results showed that the lentivirus granules bearing various interfering sequences were successfully prepared. The estable HeLa cell lines infected by lentivirus were obtained and lnc-RI expression levels was down-regulated. The results of colony formation assay showed that radiation sensitivity of the estable cell lines increased when treated with each dose gamma ray irradiation.

KEYWORDS Long non-coding RNA, lnc-RI, Lentivirus, RNA interference, Ionizing radiation

CLC TL71

長鏈非編碼RNA (Large non-coding RNA, lncRNA)是一類轉錄本長度大于200個核苷酸、絕大部分沒有長閱讀框架、沒有編碼蛋白質的功能、但像mRNA一樣具有帽式結構和poly A尾巴的基因轉錄產物[1]。隨著基因組技術的發(fā)展，發(fā)現在人類基因組中大部分lncRNA存在轉錄現象，但與編碼蛋白質的基因序列相比，其表達水平相對較弱[2]。lncRNA自身的表達水平不僅受到轉錄及轉錄后調控機制的嚴密調節(jié)[3]，它還具有調節(jié)多種重要的細胞生命活動的生物學功能，如lncRNA能在表觀遺傳、基因組印記、轉錄及轉錄后水平上調控基因表達、參與X染色體沉默、染色體劑量補償效應以及染色質修飾、調節(jié)細胞周期、細胞分化、維持細胞結構的完整性、 細胞內物質轉運、干細胞重新編程和熱休克反應等重要生命活動過程與人類疾病的發(fā)生、發(fā)展也有著密切聯系[4-7]。lncRNA種類眾多，目前功能明確的lncRNA數量很少。

Lnc-RI是本實驗室前期發(fā)現的輻射誘導表達的功能未知基因[8]，目前尚未見文獻對lnc-RI功能進行報道。生物信息學分析表明其為一種長鏈非編碼RNA(Gene ID: 401296)，定位于人7p22.3，全長1423 bp，我們將其命名為lnc-RI (lncRNA radiation induced)。本研究構建靶向lnc-RI的shRNA慢病毒顆粒并建立lnc-RI穩(wěn)定敲低的HeLa細胞系，初步探索lnc-RI對輻射敏感性的影響。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞、質粒和菌株

HEK293T細胞（人胚腎細胞）和Hela細胞（宮頸癌上皮細胞）為本實驗室保存。慢病毒載體包裝系統（含pGag/Po1、pRev、pVSVG及穿梭質粒pGLV2）由上海吉瑪公司構建制備，采用TIANGEN公司的高純度質粒小提中量試劑盒（離心柱形）提取質粒DNA。大腸桿菌 Top10感受態(tài)細胞、嘌呤霉素為本室保存。

1.1.2試劑

反轉錄試劑盒購自TaKaRa公司；DNA連接酶、限制性內切酶(AgeI, EcoRI) 購于MBI Fermentas；瓊脂糖DNA凝膠純化回收試劑盒購買于Biomed；高純度質粒小提中量質粒提取試劑盒購自于TIANGEN公司，質粒體轉染試劑RNAi-Mate購自吉瑪公司；TRIZOL購自ambion公司；細胞培養(yǎng)基1640、H-DMEM及胎牛血清均為Gibco公司產品。

1.1.3特異性干涉序列和 PCR引物設計及合成

表1　shRNA對應靶序列和lnc-RI及β-actin引物與探針序列Table 1 The shRNA sequence and primer, probe sequence of lnc-RI and β-actin

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)

293T細胞用含10％胎牛血清、0.1％青霉素和鏈霉素的H-DMEM培養(yǎng)基，HeLa細胞用含10％胎牛血清、0.1％青霉素和鏈霉素的1640培養(yǎng)基，5％ CO2、飽和濕度、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2干涉載體構建與鑒定

對載體LV2進行雙酶切（內切酶為AgeI和EcoRI），經瓊脂糖電泳回收新合成的載體DNA。將合成的目的DNA進行退火反應，然后用DNA連接酶將形成的雙鏈DNA與回收的載體DNA進行連接反應（反應條件：22℃，1 h）。連接后的產物轉入感受態(tài)細胞（大腸桿菌 Top10）中，挑取3?5個單克隆菌落并進行PCR鑒定，挑選鑒定陽性的克隆進行搖菌。根據質粒提取試劑盒提取質粒，用 EcoRI酶對提取的質粒用進行單酶切鑒定，酶切鑒定正確的送去公司進行基因測序分析。

1.2.3包裝、收取慢病毒顆粒

293T細胞在15cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至60％～70％融合時除去培養(yǎng)液，加8 mL無血清的H-DMEM培養(yǎng)液。取一支高壓滅菌的10 mL離心管，加入1.5 mL無血清無抗生素的H-DMEM培養(yǎng)基，然后加入含目的序列的重組干涉質粒pGLV2和不同的包裝質粒（pGag/Po1、pRev和 pVSVG），混勻，然后再取一支高壓滅菌的10 mL離心管，加入1.5 mL無血清無抗生素的H-DMEM培養(yǎng)基，再加入300 μL RNAi-Mate，靜置5 min，然后將兩管混合，靜置15 min。將混合物加到含有8 mL培養(yǎng)液的15 cm培養(yǎng)皿中，在5％ CO2、飽和濕度、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，更換為18 mL含10％血清的H-DMEM新鮮培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，將培養(yǎng)皿中細胞上清液吸至50 mL離心管，在4℃，4000 r/min，離心4 min后，將離心管上清液倒入50 mL注射器內，用0.45 μm過濾器過濾。濾液經4℃，20000 r/min，2 h離心將濃縮液收集分裝，?80℃保存（因慢病毒干涉質粒無綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)元件，故采用LV2-GFP質粒作為對照，平行操作作為參考）。

按3×104個細胞/孔的濃度接種96孔板，混勻后于37℃、5％ CO2條件下培養(yǎng)24 h。將同時獲得的對照病毒LV2-GFP原液10 μL，用含10％ FBS 的H-DMEM培液10倍稀釋3～5個梯度，加入終濃度為5 μg/mL的Polybrene促進感染。然后除去培養(yǎng)液，按100 μL/孔加入稀釋的不同梯度的病毒液，同時設立陰性對照和空白對照組，于5％ CO2、飽和濕度、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸棄96孔板中的稀釋病毒液，每孔加入100 μL 含10％ FBS的HDMEM培養(yǎng)液，于37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h。利用熒光顯微鏡分析GFP 表達情況，并計算病毒滴度(TU/mL)：

觀察平時的語文教學，我們就會發(fā)現有些學生的預習不主動，效果差，這直接影響了課堂教學效果。由于沒有預習或預習效果差，上課時他們沒法跟上預習的同學的思維，無法跟上老師的教學節(jié)奏，思考不深入，回答不深刻、不全面。因此，指導學生掌握科學的預習方法尤為重要。我覺得應從以下方面進行預習：

病毒滴度=(P×N/100×V) ×1/FD。

其中：P = ％GFP+cells；N 為轉染時的細胞數；V 為每孔加入病毒稀釋液體積(μL)；FD為稀釋因子(Dilution factor)。

1.2.4lnc-RI穩(wěn)定下調表達細胞系的構建及PCR鑒定

實驗前一天分別接種3×105個/孔HeLa細胞到6孔細胞培養(yǎng)板中，所加培養(yǎng)基為2 mL。培養(yǎng)24 h后，將攜帶不同lnc-RI干涉序列的LV2-NC、LV2-lnc-RI-1和LV2-lnc-RI-2的慢病毒上清按感染復數(Multiplicity of infection, MOI)為20，去感染HeLa細胞，同時每孔加入終濃度為10 μg/mL的Polybrene以促進慢病毒的感染力。于37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中溫育24 h后，因慢病毒感染成功的細胞具有嘌呤霉素抗性，所以更換含1.5 g/mL嘌呤霉素、10％ FBS的1640培養(yǎng)液以篩選穩(wěn)定細胞系。維持含1.5 g/mL嘌呤霉素藥物繼續(xù)培養(yǎng)3～5天，不再死亡的細胞即為lnc-RI穩(wěn)定敲低表達細胞系，替換含嘌呤霉素(0.5 g/mL)細胞培養(yǎng)液維持培養(yǎng)。將建立的穩(wěn)定細胞系分別命名為HeLa-LV2-NC、HeLa-LV2-lnc-RI-1和HeLa-LV2-lnc-RI-2。

將病毒感染的細胞系根據Trizol法提取細胞總RNA，按TAKARA試劑盒操作說明經反轉錄和PCR檢測lnc-RI 表達。PCR條件為95℃ 3 min、95℃10 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，40循環(huán)，所得實驗結果經2?△△CT法計算其相對定量值。

1.2.5細胞平板克隆形成實驗

取對數生長期的細胞HeLa-LV2-NC、HeLa-LV2-lnc-RI-1、HeLa-LV2-lnc-RI-2進行細胞計數，分別將三種細胞各按500個/孔細胞數接種于6孔細胞培養(yǎng)板。接種后24 h，分別給與0、1、2、4、6 Gy60Co γ-射線照射處理（劑量率：104.89 cGy/min），每種細胞每個劑量點接種3個復孔。照射后繼續(xù)培養(yǎng)，隔3～4d換一次液。當細胞培養(yǎng)板中出現肉眼可見的克隆時（約12d）倒掉培養(yǎng)液，用PBS洗2次，甲醇固定30 min，去固定液，自然風干后Giemsa染色30 min，流水清洗后室溫晾干，統計細胞克隆數（普通顯微鏡下計數≥50個細胞的單克隆）。計算細胞抑制率：細胞克隆抑制率=照射組克隆數目/未照射組克隆數目× 100％。

1.2.6數據處理

所有實驗均重復3次，采用SPSS17.0軟件對所得數據進行統計學分析，組間比較采用t-test，p<0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1干涉載體構建及病毒包裝

在pGLV2載體多克隆位點處插入包含不同干涉序列的雙鏈DNA片段，所得的重組質粒進行測序分析，結果比對表明：插入的干涉序列與理論設計的目的序列一致。將成功構建的干涉載體命名為LV2(U6/Puro)-lnc-RI-1和LV2 (U6/ Puro)-lnc-RI-2。

我們采用的pGag/Po1、pRev、pVSVG和pGLV2慢病毒系統共轉染293T細胞，24 h后熒光顯微鏡下觀察，同批次轉染LV2-GFP質粒的細胞大部分可見綠色熒光表達，說明慢病毒干涉體系已經順利轉染細胞。換取含有10％ FBS的H-DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h，收集細胞上清，經濃縮后獲得慢病毒上清。將制備的慢病毒顆粒分別命名為LV2-NC、LV2-lnc-RI-1和LV2-lnc-RI-2。將3×104個/孔的293T細胞接種于96孔板中，加入不同稀釋倍數的病毒上清，培養(yǎng)24 h。吸棄96孔板中的稀釋病毒液，每孔加100 μL 含10％ FBS的H-DMEM培液，培養(yǎng)72 h，收集細胞，利用同批次GFP 熒光表達比例結合稀釋倍數計算病毒滴度。如圖1所示，稀釋倍數為10?2和10?3的細胞感染效率接近100％，按照10?3為最低的飽和滴度，經計算分析，LV2-NC、LV2-lnc-RI-1 和LV2-lnc-RI-2的病毒滴度約為1×109TU/mL。

2.2穩(wěn)定干涉細胞系建立及干涉效果鑒定

將攜帶不同特異性干涉序列LV2-lnc-RI-1、LV2-lnc-RI-2和LV2-NC分別感染 Hela細胞(20 MOI)，感染后24 h加入含有嘌呤霉素(1.5 g/mL)的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d，細胞不再死亡，獲得穩(wěn)定細胞系。將各個感染慢病毒顆粒的Hela細胞系分別命名為HeLa-LV2-NC、HeLa-LV2-lnc-RI-1和Hela-LV2-lnc-RI-2。

將上述幾種感染病毒顆粒的Hela細胞系HeLa-LV2-NC、HeLa-LV2-lnc-RI-1和HeLa-LV2-lnc-RI-2分別提取總RNA后進行實時定量 PCR，以β-actin作為內參進行分析，結果如圖2所示。與對照組HeLa-LV2-NC細胞相比，干涉細胞系HeLa-LV2-lnc-RI-1和HeLa-LV2-lnc-RI-2的Lnc-RI的相對表達量分別下降為0.73和0.16，說明建立的兩個慢病毒干涉細胞系Lnc-RI的表達均受到不同程度的抑制，慢病毒干涉細胞系HeLa-LV2-lnc- RI-1 和HeLa-LV2-lnc-RI-2為有效的抑制Lnc-RI基因表達的細胞模型。

2.3細胞平板克隆形成實驗

為了分析lnc-RI對HeLa細胞輻射敏感性的影響，我們進行細胞克隆形成實驗。結果如圖3所示，對照細胞LV2-NC受照1、2、4、6 Gy劑量后，克隆數目分別為未照射組的95.7％、89.4％、68.2％、30.1％；HeLa-LV2-lnc-RI-1和Hela-LV2-lnc-RI-2細胞經l、2、4、6 Gy60Co γ-射線照射后，克隆數目分別為未照射組的92.1％、81.3％、63.0％、23.8％ 和90.5％、79.1％、53.2％、20.7％。統計學分析表明，在6 Gy以內的照射條件下，與對照細胞系相比，lnc-RI表達下調的HeLa細胞照射后克隆形成能力下降，提示lnc-RI表達下降增加HeLa細胞的放射敏感性。

3　討論

隨著芯片技術的發(fā)展和人類基因組測序的完成，越來越多的長鏈非編碼RNA為人們所熟知。到目前為止，已有100000 多種lncRNA的轉錄本被發(fā)現[9-10]，但相對于蛋白質編碼序列以及各種小分子RNA，對于lncRNA 的研究相對較少。隨著研究深入，越來越多的lncRNA的功能將被揭示。電離輻射可以造成嚴重的DNA損傷反應(DNA-damage response, DDR)，如：細胞DNA雙鏈的斷裂，堿基的錯配與缺失，細胞周期檢查點異常，細胞發(fā)生凋亡等，是發(fā)生染色體畸變、基因突變、細胞異常死亡的主要原因之一[11]。開展輻射相關lncRNA研究將有助于進一步闡明輻射誘導細胞損傷的分子機制。有研究發(fā)現，lincRNA-p21、PANDA1 (p21 associated ncRNA DNA damage activated)等 lncRNA分子參與輻射誘導細胞損傷過程[12-13]。但是，關于電離輻射相關lncRNA的研究還很少。

本研究中的lnc-RI是本實驗室前期研究篩選到的一種輻射誘導表達的一種長鏈非編碼RNA (Gene ID: 401296)[8]。目前，關于該分子沒有任何功能研究報道，我們前期研究首次發(fā)現電離輻射可以誘導lnc-RI表達上調，提示其可能參與電離輻射誘導損傷過程。本研究采用慢病毒系統建立靶向lnc-RI的干涉細胞系，并初步探索lnc-RI在輻射誘導細胞損傷中的作用。采用生物信息學方法結合RT-PCR鑒定，獲得兩條靶向lnc-RI的干涉序列，并成功制備其慢病毒顆粒，獲得兩株lnc-RI特異性下調的干涉細胞系，lnc-RI抑制效果分別為對照組的73％和16％。隨后采用克隆形成實驗，探索lnc-RI對輻射誘導細胞損傷的作用。結果分析表明，與未照射細胞相比，6 Gy照射對HeLa-LV2-lnc-RI-1、HeLa-LV2-lnc-RI-2的克隆形成抑制率分別為23.8％ 和20.7％，明顯低于對照細胞系(30.1％)，這表明，下調lnc-RI表達增強HeLa細胞的輻射敏感性。結合lnc-RI為電離輻射誘導表達，提示lnc-RI具有抗輻射損傷的作用。本研究篩選獲得靶向功能未知分子lnc-RI的干涉序列，并成功制備慢病毒顆粒，建立lnc-RI穩(wěn)定下調的HeLa細胞系，初步發(fā)現lnc-RI的抗輻射作用。

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Corresponding author:ZHOU Pingkun, doctoral tutor, professor, E-mail: zhoupk@bmi.ac.cn; Ph.D. WANG Zhidong, associate

收稿日期：初稿2015-09-17；修回2015-10-20

通訊作者：周平坤，博士生導師，研究員，E-mail: zhoupk@bmi.ac.cn；王治東，副研究員，博士，E-mail:

基金項目：國家自然科學基金面上項目(81573083)和國家自然科學基金青年項目(81402631)資助

DOI:10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.010203

中圖分類號TL71

第一作者：常誠，女，1987年6月出生，2012年畢業(yè)于華北理工大學，現為南華大學在讀研究生，公共衛(wèi)生與預防醫(yī)學專業(yè)，研究方向衛(wèi)生毒理學，E-mail: 1109308002@qq.com