鄒繼紅，王洪斌，趙春杰（.赤峰學(xué)院　醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古　赤峰　04000；.赤峰市傳染病防治醫(yī)院，內(nèi)蒙古　赤峰　04000；.沈陽(yáng)藥科大學(xué)　藥學(xué)院，遼寧　沈陽(yáng)　006）

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RP-HPLC測(cè)定伊赫烏蘭-13中的氧化苦參堿

鄒繼紅1，王洪斌2，趙春杰3
（1.赤峰學(xué)院醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古赤峰024000；2.赤峰市傳染病防治醫(yī)院，內(nèi)蒙古赤峰024000；3.沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110016）

摘要：目的：建立RP-HPLC測(cè)定伊赫烏蘭-13中氧化苦參堿含量的方法.方法：采用Shim-pack CLC-ODS柱，流動(dòng)相為甲醇-0.1%三乙胺=3∶8（磷酸調(diào)pH至3.0），檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，流速為1.0mL·min-1.結(jié)果：氧化苦參堿的濃度在4.04～40.4μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性，回歸方程為：Y＝40.113X+0.2584，（r＝0.9997）；平均加樣回收率為99.1%，RSD= 1.6%（n=9）.結(jié)論：所用方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，適用于伊赫烏蘭-13中氧化苦參堿的質(zhì)量控制.

關(guān)鍵詞：RP-HPLC；伊赫烏蘭-13；氧化苦參堿；含量測(cè)定

蒙藥伊赫烏蘭-13由土木香、苦參、梔子、茜草、懸鉤子木、山柰、訶子、川楝子、枇杷葉、紫草茸、橡子、紫草、金蓮花組成，具有清血熱之功效，臨床上主要用于頭痛、血熱上盛、目赤、高血壓等病癥[1].作者查閱相關(guān)文獻(xiàn)，未見(jiàn)測(cè)定方中主藥苦參的活性成分氧化苦參堿的含量的相關(guān)報(bào)道，為了有效控制該制劑的內(nèi)在質(zhì)量，作者以氧化苦參堿的含量作為測(cè)定指標(biāo)，采用RP-HPLC測(cè)定，方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明方法簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，其它組分不干擾氧化苦參堿的測(cè)定，可作為伊赫烏蘭-13的質(zhì)量控制方法.

1　儀器與試劑

1.1儀器

FA2104N電子天平；美國(guó)Agilent 1200高效液相色譜儀；UV759紫外可見(jiàn)分光光度計(jì).

1.2試劑

氧化苦參堿對(duì)照品（批號(hào)110780-201408，購(gòu)自北京中國(guó)藥品生物制品檢定所，含量為99.9%）；分析純?cè)噭┝姿岷腿野?；色譜甲醇；娃哈哈純凈水.蒙藥伊赫烏蘭-13（由內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥制劑室制備，批號(hào)：20140805、20141004、20141106）；陰性對(duì)照品的藥材（購(gòu)自?xún)?nèi)蒙古赤峰市中蒙醫(yī)院）.

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

Shim-pack CLC-ODS色譜柱(250mm×6.0 mm，內(nèi)徑5μm)；柱溫：室溫；流動(dòng)相為甲醇-0.1%三乙胺（3∶8，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0）；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；流速：1.0mL·min-1；進(jìn)樣體積為20μL.

2.2對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液的制備

取氧化苦參堿對(duì)照品，精密稱(chēng)取5.05mg，置于25mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解，稀釋至刻度，制得202μg·mL-1氧化苦參堿的對(duì)照品儲(chǔ)備液.吸取儲(chǔ)備液1.0mL，置于10mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，即為20.2μg·mL-1氧化苦參堿的對(duì)照品溶液.

取已研細(xì)的伊赫烏蘭-13細(xì)粉4.0g，精密稱(chēng)定，置于250mL具塞錐形瓶中，加入0.1mL氨水，25mL無(wú)水乙醇，密塞，超聲溶解30min，放冷至室溫，用濾紙濾過(guò)，濾器與錐形瓶用無(wú)水乙醇洗滌4次，每次5mL，將濾液與洗液合并，并于水浴上蒸干，蒸干的殘?jiān)昧鲃?dòng)相溶解，并定容至10mL.再用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，制得供試品溶液.

依據(jù)伊赫烏蘭-13的處方要求，制備不含苦參堿的樣品，按制備供試品溶液同樣的方法進(jìn)行制備，濾過(guò)，制得陰性樣品溶液.

2.3專(zhuān)屬性試驗(yàn)

分別吸取20μL陰性樣品溶液、氧化苦參堿對(duì)照品溶液和供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)的色譜條件下，注入高效液相色譜儀，所得圖譜如圖1所示.由圖可以看出：陰性樣品不干擾氧化苦參堿的測(cè)定，氧化苦參堿的保留時(shí)間約4.3min左右，與其他組分可達(dá)到基線分離.

2.4穩(wěn)定性考察

吸取20μL同一份供試品溶液，分別于室溫放置0、1、2、4、6、8、10h時(shí)注入高效液相色譜儀，測(cè)定氧化苦參堿的峰面積，RSD=1.9%，表明供試品溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定，滿(mǎn)足測(cè)定要求.

2.5重復(fù)性考察

取同一批伊赫烏蘭-13樣品（批號(hào)20141106），精密稱(chēng)取適量，按“2.2”的方法制備供試品溶液6份，在“2.1”項(xiàng)的色譜條件下，將供試品溶液注入高效液相色譜儀，測(cè)定氧化苦參堿的峰面積，計(jì)算可得平均含量為0.056mg·g-1，RSD=1. 8%，說(shuō)明方法的重復(fù)性很好.

圖1　高效液相色譜圖

2.6精密度考察

分別吸取20μL供試品溶液和氧化苦參堿對(duì)照品溶液，注入高效液相色譜儀，測(cè)定氧化苦參堿的峰面積，重復(fù)測(cè)定6次，樣品的RSD=1.5%，對(duì)照品的RSD=0.9%，說(shuō)明儀器的精密度很好.

2.7線性范圍考察

在6個(gè)50mL量瓶中，分別加入氧化苦參堿對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0、2.0、6.0、8.0、10.0mL，加流動(dòng)相稀釋刻度，得到6個(gè)濃度的苦參堿對(duì)照品溶液.分別吸取6個(gè)對(duì)照品溶液各20μL，分別注入高效液相色譜儀，測(cè)定氧化苦參堿的峰面積.以峰面積為縱坐標(biāo)，氧化苦參堿的濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為:Y=40.113X+0.2584，（r=0. 9997）.結(jié)果表明氧化苦參堿濃度在4.04～40.4μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系.

2.8加樣回收率試驗(yàn)

分別精密稱(chēng)取9份氧化苦參堿含量已知的同一批（批號(hào)20141106，含量為0.056mg·g-1）樣品粉末3.0g，依次加入202μg·mL-1的氧化苦參堿對(duì)照品儲(chǔ)備液0.6、0.8和1.0mL，按“2.2”項(xiàng)下的方法進(jìn)行處理，吸取20μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定氧化苦參堿的峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果如表1所示.

2.9樣品的測(cè)定

取3個(gè)批號(hào)樣品（20140805、20141004、20141106），按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別吸取20μL氧化苦參堿對(duì)照品溶液和3份供試品溶液，注入高效液相色譜儀，測(cè)定氧化苦參堿的峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算氧化苦參堿的含量，結(jié)果3批樣品的平均含量分別為0.054、0.057和0.058 mg·g-1.

表1　加樣回收率結(jié)果（n=9）

3　討論

試驗(yàn)過(guò)程中，采用UV-759紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描氧化苦參堿的紫外吸收光譜圖，最大吸收波長(zhǎng)為206nm，而甲醇的截止波長(zhǎng)為210nm，導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果偏高，故選取檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，可消除甲醇的干擾，保證氧化苦參堿的色譜峰基線平穩(wěn).選擇流動(dòng)相時(shí)，作者參考部分相關(guān)文獻(xiàn)，嘗試采用乙腈-無(wú)水乙醇-磷酸溶液[2]、乙腈-水[3]、乙腈-磷酸二氫鉀-十二烷基硫酸鈉-水[4]、磷酸-甲醇[5]作為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿的色譜峰嚴(yán)重拖尾或與其他組分無(wú)法完全分離.經(jīng)過(guò)反復(fù)多次試驗(yàn)，最后當(dāng)采用甲醇-0.1%三乙胺（3∶8，磷酸調(diào)pH至3.0）時(shí)，氧化苦參堿峰的對(duì)稱(chēng)因子符合要求，與其他組分的分離度良好.蒸干溶劑后分別采用無(wú)水乙醇和流動(dòng)相溶解殘?jiān)?，通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相溶解的樣品中氧化苦參堿的色譜峰與其他組分的色譜峰分離度均≥1.5，且譜圖干凈，故最終采用流動(dòng)相溶解殘?jiān)?

參考文獻(xiàn)：

〔1〕白清云.中國(guó)醫(yī)學(xué)百科全書(shū)·蒙醫(yī)學(xué)[M].上海:上海科技出版社，1992.260.

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基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助（2013MS1217）

收稿日期：2015-09-24

中圖分類(lèi)號(hào)：R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-260X（2016）01-0019-02