金明，高峰，金梅花，全吉淑（延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林延吉133002）

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祁州漏蘆對(duì)D-氨基半乳糖所致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用

金明，高峰，金梅花，全吉淑*
（延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林延吉133002）

摘要：研究祁州漏蘆提取物對(duì)D-氨基半乳糖（GalN）誘發(fā)的小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。將小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、聯(lián)苯雙脂組、祁州漏蘆乙醇提取物組、祁州漏蘆正丁醇層萃取物組和水層萃取物組。每日給藥1次，連續(xù)7 d。實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?，腹腔注射GalN建立急性肝損傷模型。比色法檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）以及肝臟誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、超氧化物歧化酶（SOD）水平。祁州漏蘆不同溶劑層提取物顯著降低GalN致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST活性（P＜0.05）；降低肝組織iNOS和NO水平，降低肝線粒體MDA水平（P＜0.05）；升高肝線粒體GPx、SOD活性和GSH水平（P＜0.05）。祁州漏蘆提取物對(duì)GalN致急性肝損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其抗氧化和抗炎作用有關(guān)。

關(guān)鍵詞：祁州漏蘆；D-氨基半乳糖；肝損傷；抗氧化

祁州漏蘆（Rhaponticum uniflorum（L.）DC）為多年生草本，分布于我國東北、內(nèi)蒙古、陜西、河北、甘肅等地區(qū)。具有清熱解毒、排膿消腫、通乳的功能，主治乳腺炎、腮腺炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、淋巴結(jié)結(jié)核、痔瘡等[1]。研究表明，祁州漏蘆具有抗氧化、抗衰老、抗炎、增強(qiáng)免疫及抗腫瘤等藥理作用[2-4]。近年來，祁州漏蘆在肝病防治中的應(yīng)用也越來越受關(guān)注。研究表明，祁州漏蘆對(duì)四氯化碳以及對(duì)乙酰氨基酚所致化學(xué)性肝損傷具有保護(hù)作用[5-6]。本文將研究祁州漏蘆不同溶劑萃取物對(duì)D-氨基半乳糖（GalN）致小鼠急性肝損傷的干預(yù)作用，探討祁州漏蘆的保肝作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用雄性昆明小鼠：延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[體重22 g~26 g，合格證號(hào)：SCXK（吉）2008-0005]。GalN：（批號(hào)：085k1321）Sigma公司；聯(lián)苯雙脂（BFD）滴丸（批號(hào)：20091024）：北京協(xié)和藥廠；兔誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）多克隆抗體：美國Abcam公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、一氧化氮合酶（NOS）、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）及蛋白質(zhì)測(cè)試盒：購于南京建成科技有限公司。

3-30K型離心機(jī)：德國Sigma公司；S22PC型分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；DYY-12型電泳儀、DYCP-31D型電泳槽、DYCZ-24DN型電泳儀：北京六一儀器廠；Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽：美國Bio-Rad公司；UVP凝膠成像分析儀：美國UVP公司。

1.2方法

1.2.1祁州漏蘆的提取工藝

祁州漏蘆采自吉林省長白山，經(jīng)延邊大學(xué)藥學(xué)院劉勇鎮(zhèn)教授鑒定為祁州漏蘆Rhaponticum uniflorum （L.）DC。將祁州漏蘆切碎后，用90%乙醇回流提取2h，共3次，合并濾液，經(jīng)減壓濃縮即得祁州漏蘆乙醇提取物（RUEE），得率為8.7 %。將乙醇提取物加水溶解，用等體積乙酸乙酯和正丁醇萃取，得正丁醇層萃取物（RUBF）和水層萃取物（RUAF）[4]。

1.2.2模型的復(fù)制與分組、給藥

將小鼠隨機(jī)分為6組，即正常組、模型組、RUEE組、RUBF組、RUAF組和BFD（聯(lián)苯雙酯）組（陽性對(duì)照組）。治療組小鼠按200 mg/（kg·d）劑量灌胃給藥，BFD組按100 mg/（kg·d）劑量灌胃給藥，每日1次，連續(xù)7 d。藥物的劑量選擇主要根據(jù)課題組前期研究及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果而定的[2，5-6]。正常組及模型組小鼠則灌胃等體積生理鹽水。末次給藥1h后，除正常組腹腔注射等體積生理鹽水外，其余各組小鼠一次性腹腔注射給予500 mg/kg GalN。造模期間禁食，不禁水。

1.2.3血清生化指標(biāo)的檢測(cè)

造模24 h后處死小鼠，眼球取血，分離血清，檢測(cè)小鼠血清ALT、AST活性。

1.2.4肝組織抗炎、抗氧化指標(biāo)及DNA損傷的檢測(cè)

常規(guī)方法制備肝線粒體。肝組織用磷酸鹽緩沖鹽水在冰浴中均質(zhì)處理，600 r/min離心取上清為肝勻漿。肝勻漿在10 000 r/min離心，取沉淀懸浮于磷酸鹽緩沖液中，用超聲波處理，在8 000 r/min離心得肝線粒體液。按照各測(cè)試盒操作方法測(cè)定iNOS、NO、MDA、GSH、GPx、SOD及蛋白質(zhì)水平。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果與分析

2.1祁州漏蘆提取物對(duì)肝損傷小鼠血清ALT、AST活性的影響

血清ALT和AST是評(píng)價(jià)急性肝損傷程度的常用指標(biāo)，見表1。

表1祁州漏蘆提取物對(duì)血清ALT和AST活性的影響Table 1 Effect of Rhaponticum uniflorum extracts on serum ALT and AST

表1祁州漏蘆提取物對(duì)血清ALT和AST活性的影響Table 1 Effect of Rhaponticum uniflorum extracts on serum ALT and AST

注：-表示無劑量；與正常組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05。

組別　　劑量/（mg/kg）　ALT/（μmol/s·L）　AST/（μmol/s·L）正常組　?。?.65±0.63　4.96±0.97模型組　?。?5.3±1.94*　10.4±1.45*RUEE組　200　10.8±1.63#　7.5±1.34#RUBF組　200　10.1±1.85#　6.4±1.29#RUAF組　200　11.6±2.02#　7.7±1.42#BFD組　100　9.23±1.27#　6.1±1.23#

由表1可見，與正常組比較，模型組小鼠血清ALT、AST活性升高（P＜0.05）。與模型組比較，RUEE、RUBF和RUAF組小鼠血清ALT和AST活性降低（P＜0.05）。單純從轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)來看，RUAF與RUBF的保肝活性差不多，較弱于BFD。

2.2祁州漏蘆提取物對(duì)肝損傷小鼠肝線粒體GPx、SOD、GSH和MDA水平的影響

GalN經(jīng)不同途徑導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)破壞，引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加，抑制線粒體呼吸功能，產(chǎn)生氧自由基和氧化應(yīng)激。結(jié)果見表2。

表2祁州漏蘆提取物對(duì)肝線粒體GPx、SOD、GSH和MDA水平的影響Table 2 Effect of Rhaponticum uniflorum extracts on GPx，SOD and GSH of liver mitochondria

表2祁州漏蘆提取物對(duì)肝線粒體GPx、SOD、GSH和MDA水平的影響Table 2 Effect of Rhaponticum uniflorum extracts on GPx，SOD and GSH of liver mitochondria

注：-表示無劑量；與正常組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05。

組別　　劑量/ （mg/kg）GPx/ （U/mg）SOD/ （U/mg）GSH/ （nmol/mg）MDA/ （nmol/mg）正常組　?。?87.1±28.3 65.3±10.6 38.7±4.3　 2.31±0.42模型組　　－　130.3±20.4*40.2±8.5*24.4±3.7*3.57±0.75*RUEE組　200　 168.5±20.3#49.8±8.3#31.6±5.4#2.68±0.52#RUBF組　200　 175.2±24.9#51.8±9.2#34.2±6.1#2.69±0.46#RUAF組　200　 153.4±23.4#53.7±10.3#32.7±4.7#2.53±0.59#BFD組　100　 192.1±25.6#60.4±10.4#34.5±5.6#1.28±0.37#

由表2可見，與正常組比較，模型組小鼠肝線粒體GPx、SOD、GSH水平降低（P<0.05），MDA含量增高（P<0.05）；與模型組比較，RUEE組、RUBF組和RUAF組肝線粒體GPx、SOD、GSH含量增高（P<0.05），MDA水平降低（P<0.05）。

2.3祁州漏蘆提取物對(duì)急性肝損傷小鼠肝組織iNOS 及NO水平的影響

祁州漏蘆提取物對(duì)肝組織iNOS蛋白水平的影響結(jié)果見表3和圖1。

表3祁州漏蘆提取物對(duì)肝組織iNOS活性和NO水平的影響Table 3 Effect of Rhaponticum uniflorum extracts on hepatic iNOS and NO

表3祁州漏蘆提取物對(duì)肝組織iNOS活性和NO水平的影響Table 3 Effect of Rhaponticum uniflorum extracts on hepatic iNOS and NO

注：-表示無劑量；與正常組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05。

組別　　劑量/（mg/kg）　iNOS/（U/mg）　NO/（μmol/g）正常組　?。?.25±0.07　2.7±0.6模型組　?。?.64±0.12*　 7.8±1.1*RUEE組　200　0.37±0.08#　 4.6±0.9#RUBF組　200　0.38±0.07#　 5.5±1.1#RUAF組　200　0.35±0.06#　 5.2±1.0#BFD組　100　0.31±0.07#　 4.6±0.7#

圖1祁州漏蘆提取物對(duì)肝組織iNOS蛋白水平的影響Fig.1 Effect of Rhaponticum uniflorum extracts on protein expression of iNOS in liver注：與正常組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05。

與正常組比較，模型組小鼠肝組織iNOS蛋白表達(dá)及活性顯著升高（P＜0.05）；NO水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，RUEE組、RUBF組和RUAF組小鼠肝iNOS蛋白表達(dá)和活性、以及NO水平顯著降低（P＜0.05）。

3　討論

GalN可造成肝彌漫性壞死和炎癥，其所致急性肝損傷模型與人類病毒性肝炎的病理學(xué)變化相似，是篩選保肝藥物和研究藥物作用機(jī)制的經(jīng)典動(dòng)物模型。GalN是肝細(xì)胞磷酸尿嘧啶核苷的干擾劑，通過競(jìng)爭(zhēng)生成二磷酸尿苷半乳糖使磷酸尿苷耗竭，導(dǎo)致肝細(xì)胞代謝障礙，造成肝臟彌漫性壞死和炎癥，其肝臟病理和生化改變與人類病毒性肝炎極為相似，是保肝、降酶新藥藥理實(shí)驗(yàn)首選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[7]。GalN經(jīng)不同途徑導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)破壞，引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加，抑制線粒體呼吸功能，產(chǎn)生氧自由基。而AST和ALT的活性變化成為最常用的判定藥物護(hù)肝作用及藥物抗氧化作用的重要指標(biāo)。一般認(rèn)為，ALT活性上升作為肝細(xì)胞漿膜損傷的標(biāo)志，而AST活性作為線粒體損傷的重要指標(biāo)，因?yàn)锳ST主要來源于線粒體[8-9]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠血清ALT、AST水平升高，而祁州漏蘆萃取物預(yù)處理組小鼠血清ALT、AST活性降低，提示祁州漏蘆萃取物可減輕GalN所致小鼠急性肝損傷程度。在炎癥反應(yīng)中NO大量釋放也被人們關(guān)注和廣泛研究。NO可直接抑制線粒體呼吸，使肝細(xì)胞內(nèi)能量代謝障礙而引起肝細(xì)胞凋亡和壞死[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GalN處理可增高肝損傷小鼠肝組織iNOS活性和NO水平，而祁州漏蘆萃取物預(yù)處理可降低肝iNOS活性和NO水平，從而減少炎癥反應(yīng)的發(fā)生。同時(shí)，模型組小鼠肝線粒體MDA水平升高，肝線粒體SOD、GPx、GSH水平降低，表明急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞存在一定程度的氧化應(yīng)激損傷[11]。而祁州漏蘆萃取物預(yù)處理組小鼠肝線粒體MDA水平降低，GSH含量和抗氧化酶活性增高。綜上所述，祁州漏蘆萃取物對(duì)GalN所致小鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用，可通過清除機(jī)體內(nèi)自由基和抑制脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而保護(hù)肝細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。其不同萃取物保肝活性相近，這與RUBF的體外抗氧化活性較高于RUAF的結(jié)果不吻合[2]。這可能與其成分的復(fù)雜性、體內(nèi)外抗氧化作用不完全一致有關(guān)。其原因還需進(jìn)一步研究。

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Protective Effect of Rhaponticum uniflorum on Acute Liver Injury Induced by D-Galactoamine in Mice

JIN Ming，GAO Feng，JIN Mei-hua，QUAN Ji-shu*
（Medical College，Yanbian University，Yanji 133002，Jilin，China）

Abstract：To investigate the protective effect of Rhaponticum uniflorum extracts on liver injury induced by D-galactoamine（GalN）inmice，micewererandomlyassignedtothenormalcontrol，model，bifendate，Rhaponticum uniflorum ethanol extract，as well as the butanol（RUBF）and aqueous fractions of Rhaponticum uniflorum. Animals were treated once daily for 7 days. At the end of the experiment，GalN was given intraperitoneally to the mice of groups，then the alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），inducible nitric oxide synthase（iNOS），nitric oxide（NO），malondialdehyde（MDA），glutathione（GSH），glutathione peroxidase（GPx）and superoxide dismutase（SOD）were detected with the colorimetric method. The results showed that the administration with different solvent fractions of Rhaponticum uniflorum reduced the serum activities of ALT and AST（P＜0.05），decreased hepatic iNOS and NO level，decreased the MDA content and increased GPx，SOD and GSH levels of liver mitochondria in mice with acute liver injury（P＜0.05）. This study showed that Rhaponticum uniflorum extracts had protective effects on acute liver injury induced by GalN in mice，probably via anti-oxidative and anti-inflammatory activities.

Key words：Rhaponticum uniflorum；D-galactoamine；liver injury；anti-oxidative

收稿日期：2014-09-26

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.001

*通信作者：全吉淑（1968—），女（朝鮮），教授，博士，研究方向：中藥藥理學(xué)。

作者簡(jiǎn)介：金明（1972—），女（朝鮮），副教授，博士，研究方向：中藥藥理學(xué)。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81160539）