種世桂，趙玉敏

（桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541004）

人狂犬病病例的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)及應(yīng)用原則

種世桂，趙玉敏

（桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541004）

我國是狂犬病疫情最嚴(yán)重的地區(qū)之一，在世界范圍內(nèi)年報(bào)告死亡人數(shù)僅次于印度。雖然近年狂犬病報(bào)告病例數(shù)逐年下降，但疫區(qū)不斷擴(kuò)大。我國的人狂犬病病例報(bào)告大部分基于臨床癥狀及病例的流行病史，基于實(shí)驗(yàn)室診斷報(bào)告的病例為數(shù)甚少。而WHO要求狂犬病病例報(bào)告具有實(shí)驗(yàn)室診斷依據(jù)；國家新的監(jiān)測(cè)方案也要求所有報(bào)告病例均應(yīng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)?；谝陨媳尘?，本文著重對(duì)人狂犬病病例的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)及其應(yīng)用原則進(jìn)行綜述，以期為我國今后狂犬病病例的監(jiān)測(cè)及實(shí)驗(yàn)室診斷提供借鑒。

人狂犬病病例；狂犬??；狂犬病毒；實(shí)驗(yàn)室診斷

狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染引起的人獸共患烈性傳染病，屬于中華人民共和國乙類法定報(bào)告?zhèn)魅静?，病死率將?00%。我國狂犬病病例大多是依據(jù)動(dòng)物咬傷史和典型的臨床表現(xiàn)而確定的臨床診斷病例，實(shí)驗(yàn)室診斷病例相當(dāng)有限。隨著循證醫(yī)學(xué)的發(fā)展，實(shí)驗(yàn)室診斷的地位日益突出。一方面，狂犬病潛伏期長短的不確定（幾周到幾年不等）、與其他腦炎在臨床表現(xiàn)上具有相似性，極易誤診或漏診。另一方面，按照WHO對(duì)于疾病診斷的要求，狂犬病病例的診斷除傳統(tǒng)的由癥狀、病史作出臨床診斷外，其確診更應(yīng)依賴于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的病原學(xué)診斷，以及時(shí)正確進(jìn)行暴露后患者的針對(duì)性處理及帶毒動(dòng)物的處置，避免狂犬病的進(jìn)一步播散。因此，在條件允許的情況下，所有可能或者疑似的臨床狂犬病病例都要用實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行確診。本文主要介紹了目前應(yīng)用于人狂犬病例診斷的實(shí)驗(yàn)室診斷方法及其應(yīng)用原則，并比較了各自的優(yōu)缺點(diǎn)，為人狂犬病病例的早期診斷和深入研究以及進(jìn)一步的預(yù)防和控制提供理論基礎(chǔ)。

1　狂犬病病例的診斷

根據(jù)《狂犬病診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS281-2008）》，同時(shí)參考世界衛(wèi)生組織《狂犬病咨詢報(bào)告（第二版）》中實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，臨床診斷為腦炎的病例都要引起警覺；若條件允許，所有狂犬病可疑病例都要用實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行證實(shí)?？袢〉呐R床定義：病例具有急性神經(jīng)綜合癥 （如腦炎），主要表現(xiàn)為過動(dòng)綜合征（如狂躁型狂犬?。┗蛘呗楸跃C合征（如早癱性狂犬?。?，漸漸發(fā)展為昏迷或死亡。如果沒有重癥監(jiān)護(hù)，病人通常會(huì)在首發(fā)癥狀出現(xiàn)后7～11d內(nèi)死于循環(huán)或呼吸衰竭［1］。

2　人狂犬病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)

狂犬病病毒的特異性檢測(cè)是確診的必要條件，建立并普及特異性檢測(cè)技術(shù)對(duì)該病是預(yù)防和診治都有重要意義。狂犬病病毒包涵體的特異性不強(qiáng)，與其它疾病易于混淆，通過觀察中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元胞漿內(nèi)的包涵體、內(nèi)基式小體的組織病理學(xué)方法已經(jīng)很少在世界各地應(yīng)用。目前我國狂犬病例實(shí)驗(yàn)室診斷常用的技術(shù)包括DFA、RFFIT、RT-PCR、巢式PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等等。

2.1熒光抗體試驗(yàn)（FluorescentAntibody Test，F(xiàn)AT）

熒光抗體試驗(yàn)（FAT）［2］是通過狂犬病病毒抗原的單克隆抗體或者多克隆抗體來檢測(cè)樣本中狂犬病病毒的方法。DFA是狂犬病毒抗原檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，是狂犬病實(shí)驗(yàn)室診斷最快速、最可靠的方法［3］，其原理為：感染狂犬病毒的細(xì)胞攜帶的狂犬病毒抗原，可以特異性地與FITC標(biāo)記的抗狂犬病毒單克隆抗體相結(jié)合，在顯微鏡下可以直接觀察到的FITC的可見熒光了解到抗原抗體之間的特異性反應(yīng)。陽性結(jié)果表明狂犬病毒感染，有確診意義［4］。該法可檢測(cè)新鮮病料、甲醛固定的標(biāo)本或甘油保存的樣品，也可檢測(cè)臨床狂犬病人的皮膚活檢物或毛囊，甚至是冰凍幾小時(shí)內(nèi)的皮膚活組織或角膜印片中的病毒抗原［5］。

2.2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme1inkedimmunosorbentassay，ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）主要根據(jù)抗原抗體結(jié)合反應(yīng)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目標(biāo)，不僅能評(píng)估動(dòng)物免疫水平，還可用于檢測(cè)腦組織中狂犬病病毒核衣殼蛋白。應(yīng)用在狂犬病的診斷方面主要依賴狂犬病毒抗原進(jìn)行，ELISA檢測(cè)狂犬病抗原是PerrinP于1986年建立的，通過使用抗狂犬病毒特異性單克隆抗體包被塑料板，與標(biāo)本中的待檢抗原結(jié)合，其中待檢抗原又與后加入的辣根過氧化物酶標(biāo)記抗狂犬病毒單克隆抗體特異性結(jié)合，再通過辣根過氧化物酶與底物作用產(chǎn)生可見的顏色反應(yīng)，最終達(dá)到檢測(cè)目的。其顯色程度與待檢抗原含量呈正相關(guān)［4］。

2.3快速狂犬病酶免疫診斷法（rapidrabiesenzy meimmunodiagnosis，RREID）

快速狂犬病酶免疫診斷法（RREID）是一種簡單的常規(guī)診斷狂犬病的快速酶免疫診斷技術(shù)，也是WHO推薦的抗原檢測(cè)方法，通過檢測(cè)腦組織中的狂犬病病毒核蛋白來診斷狂犬病。

2.4快速熒光灶抑制試驗(yàn)（rapid fluorescentfocus inhibition test，RFFIT）

快速熒光灶抑制試驗(yàn)（RFFIT）是WHO狂犬病專家委員會(huì)推薦的檢測(cè)狂犬病病毒中和抗體的標(biāo)準(zhǔn)方法［1］，是以熒光灶為指示系統(tǒng)的血清中和試驗(yàn)。通過將待測(cè)血清與攻擊病毒進(jìn)行中和反應(yīng)后，接種體外細(xì)胞，用熒光抗體試驗(yàn)（FAT）檢測(cè)剩余病毒從而計(jì)算中和抗體效價(jià)［2，15，16］。試驗(yàn)中應(yīng)盡量減小樣品的污染；冷丙酮固定-20℃較-4℃效果要好，固定時(shí)間應(yīng)大于10min，最好能達(dá)到半個(gè)小時(shí)；試驗(yàn)完成后盡快鏡檢以防熒光信號(hào)淬滅影響結(jié)果。RFFIT可以在24h內(nèi)檢測(cè)出抗體水平，除了應(yīng)用于狂犬病疫苗接種者血清中和抗體水平檢測(cè)外，還可應(yīng)用于動(dòng)物接種試驗(yàn)、細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)上的中和試驗(yàn)、抗狂犬病病毒糖蛋白抗體檢測(cè)試劑盒的評(píng)估、中和性單克隆抗體的鑒定和評(píng)價(jià)以及被動(dòng)免疫制劑的效能評(píng)估等方面。RFFIT實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，實(shí)驗(yàn)試劑及儀器要求較高，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員要求高，其檢測(cè)結(jié)果受到操作人員的熟練程度及主觀判定因素、病毒種子的質(zhì)量、標(biāo)準(zhǔn)血清和樣品的質(zhì)量、抗體濃度以及實(shí)驗(yàn)對(duì)照系統(tǒng)情況等因素影響。

2.5熒光抗體病毒中和試驗(yàn)（fluorescentantibody virus neutralization test，F(xiàn)AVNT）

熒光抗體病毒中和試驗(yàn)（FAVNT）是OIE認(rèn)定的狂犬病抗體檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法，目前在WHO和OIE狂犬病參考實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用較廣［21］。FAVNT也是一種抗原抗體中和反應(yīng)試驗(yàn)方法，將一定量的血清與狂犬病毒CVS（適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)攻毒毒株）在體外中和，然后接種對(duì)狂犬病病毒敏感的細(xì)胞，血清稀釋度能100%中和病毒，且當(dāng)血清滴度在50%以上就有中和病毒的能力。該試驗(yàn)對(duì)血清質(zhì)量要求較高，細(xì)胞對(duì)毒素太敏感，血清內(nèi)所含毒素較多可導(dǎo)致假陽性的發(fā)生。FAVNT敏感性、特異性強(qiáng)，可進(jìn)行較大樣本的檢測(cè)，但其操作過程較復(fù)雜，所需時(shí)間較長（至少一天），通常僅作為輔助診斷方法而不作為常規(guī)方法。

2.6PCR（Polymerse Chain Reaction，PCR）檢測(cè)技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是1983年Millis發(fā)明的一種核酸體外擴(kuò)增系統(tǒng)，以雙鏈DNA分子堿基配對(duì)為原則，采用耐熱DNA聚合酶和DNA合成引物，以目的基因?yàn)槟０逶隗w外特異性擴(kuò)增DNA片段。PCR技術(shù)靈敏度高、診斷快速，適用于大批量樣品的狂犬病毒毒株核酸檢測(cè)，還可用于唾液、腦脊液等不適合做DFA的標(biāo)本。但其對(duì)試驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)設(shè)備、操作人員的要求相當(dāng)嚴(yán)苛，極易造成假陽性或者假陰性。目前，狂犬病病毒核酸的檢測(cè)技術(shù)只作為狂犬病診斷技術(shù)的輔助性或確定性方法。

2.6.1逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）

狂犬病毒為負(fù)鏈RNA病毒，PCR擴(kuò)增前需要先完成逆轉(zhuǎn)錄、合成第一條cDNA鏈（RT）再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerasechainreaction，RT-PCR）?；谶@一原理，設(shè)計(jì)狂犬病毒基因片段特異性擴(kuò)增引物，將可疑狂犬病人的標(biāo)本進(jìn)行核酸提取、特異性擴(kuò)增和檢測(cè)，陽性結(jié)果可以明確狂犬病毒感染，確診狂犬?。?］。

2.6.2巢式PCR（nested-PCR）

巢式PCR（nested-PCR）是由普通PCR發(fā)展而來的一種PCR技術(shù)，是一種常用的檢測(cè)狂犬病病毒的分子生物學(xué)方法。其原理是設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，其中一對(duì)引物在另一對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物的片段上，通過二次PCR反應(yīng)對(duì)某個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)。診斷狂犬病可以通過核苷酸序列測(cè)定、RT-PCR產(chǎn)物的多態(tài)性分析，或者針對(duì)各基因型設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行巢式PCR實(shí)現(xiàn)。巢式PCR的靈敏度和特異性比RT-PCR更好，也可作為狂犬病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)之一。

2.6.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-TimePCRor qRT-PCR）

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種由PCR技術(shù)發(fā)展而來的檢測(cè)技術(shù)，在反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光探針等熒光物質(zhì)，利用熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知起始模板定量分析的方法。該技術(shù)實(shí)行完全閉管式操作，大大減少擴(kuò)增產(chǎn)物污染的機(jī)會(huì)，還具有操作簡單、快速高效、靈敏度高、特異性強(qiáng)、動(dòng)力學(xué)范圍寬及高通量等優(yōu)點(diǎn)，極大地克服了原有PCR技術(shù)的不足，廣泛應(yīng)用于核酸定量分析中。但由于該技術(shù)成本較高，在大部分實(shí)驗(yàn)開展比較困難，短期內(nèi)難以普及。

3　狂犬病病例實(shí)驗(yàn)室診斷的關(guān)鍵步驟

3.1狂犬病實(shí)驗(yàn)室診斷的生物安全

在狂犬病相關(guān)工作中，安全至關(guān)重要。所有狂犬病診斷及相關(guān)工作的參與人員均應(yīng)事先接種狂犬疫苗并證實(shí)已獲得完全性保護(hù) （血清抗體≥0.5IU/mL）。通常，對(duì)動(dòng)物處理、尸體解剖、收集準(zhǔn)備品、樣本處理等常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室活動(dòng)應(yīng)在生物安全I(xiàn)I級(jí)實(shí)驗(yàn)室完成。在某些情況下，如生產(chǎn)大量濃縮病毒、進(jìn)行會(huì)產(chǎn)生氣溶膠的操作（例如同質(zhì)化的組織懸液）、不清楚當(dāng)前的預(yù)防措施對(duì)所接觸的狂犬病病毒防護(hù)效果如何，可考慮采用生物安全I(xiàn)II級(jí)實(shí)驗(yàn)室。應(yīng)該遵守所有涉及感染性物質(zhì)工作的國家安全指南。

3　結(jié)論與展望

隨著診斷技術(shù)的不斷發(fā)展進(jìn)步，我國報(bào)告法定傳染病的實(shí)驗(yàn)室診斷率不斷提高，但仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于西方國家的實(shí)驗(yàn)室診斷率。不同的可疑狂犬病病料需要恰當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)室方法才能明確診斷。規(guī)范化的診斷程序在狂犬病例確診上具有極其重要的作用；快速準(zhǔn)確得出狂犬病實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果對(duì)病人的暴露后治療、受暴露馴養(yǎng)動(dòng)物的預(yù)防處置至關(guān)重要。狂犬病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的進(jìn)一步推廣，我國狂犬病實(shí)驗(yàn)室診斷率的提高，適用于野外和實(shí)驗(yàn)室操作的簡單、特異且敏感的病毒抗原檢測(cè)、血清抗體監(jiān)測(cè)及病毒核酸檢測(cè)的方法等等，都有待進(jìn)一步研究。

［1］ WHO expert consultation on rabies.Second report.World Health Organ Tech Rep Ser.2013，（982）：1-139.

［2］ 扈榮良.狂犬病理論、技術(shù)與防治［M］.北京：科學(xué)出版社，2007.

［3］ Meslin F X，Kaplan M M，Koprowski H.Laboratory techniques in rabies，F(xiàn)ourth edition，WHO，Geneva，1996，88-95.

［4］ 中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)：狂犬病診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS2 81-2008）［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008.

［5］ 李靜.狂犬病的實(shí)驗(yàn)室診斷在臨床狂犬病診斷中應(yīng)用的研究［D］.瀘州醫(yī)學(xué)院，四川：2009.

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