微孔板法測定乳粉中葉酸含量的前處理方法優(yōu)化

葉酸，是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)相似、生化特征相近的化合物統(tǒng)稱，由蝶啶、對氨基苯甲酸和一個或多個谷氨酸結(jié)合而成，是維生素B復(fù)合體之一[1]。它具有促進(jìn)骨髓中幼細(xì)胞成熟，改善血管內(nèi)皮功能、預(yù)防心血管疾病等作用，缺乏葉酸可能引起人體巨紅細(xì)胞性貧血以及白細(xì)胞減少癥[2-3]。葉酸是乳粉中重要的營養(yǎng)物質(zhì)之一，為了保障乳粉的質(zhì)量安全，開展乳粉中葉酸的檢驗方法研究顯得十分重要。

葉酸常用的檢測方法有比色法[4]、薄層層析法[5]、同位素放射免疫法[6]、色譜法[7]、微生物法等[8-9]。在我國的食品標(biāo)準(zhǔn)中，微生物法是檢測食品中葉酸含量的主要方法。尤其是在傳統(tǒng)的微生物法基礎(chǔ)上微量化和簡便化發(fā)展的微孔板法備受青睞[10]。但是由于乳粉的基質(zhì)比較復(fù)雜，使用微孔板法進(jìn)行葉酸檢驗時，前處理條件對實驗結(jié)果的影響顯著。本文通過考察微孔板法中提取溫度、提取時間和離心轉(zhuǎn)速等前處理條件對實驗結(jié)果的影響，尋找最優(yōu)的前處理條件，以利于保證測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

儀器與試劑 儀器 電子天平（梅特勒PL2002）、酶標(biāo)儀（Multiskan Mk3型）、生化培養(yǎng)箱（PHX-330H）、數(shù) 顯 恒 溫 水 浴 鍋（HH-4）、pH計（Mettler Toledo FE20）、臺式高速冷凍離心機（湘儀H1850R）。

試劑 包被有鼠李糖桿菌的微孔板、葉酸培養(yǎng)基、葉酸標(biāo)準(zhǔn)品、葉酸緩沖液、無菌水。以上試劑均來自VitaFast Folic Acid 定量檢測試劑盒

磷酸鹽緩沖液（0.05mol/L，pH7.2）：將7.8g磷酸二氫鈉（廣州化學(xué)試劑廠）加入1L去離子水中，調(diào)節(jié)pH至7.2，緩沖液需要當(dāng)天制備。

實驗樣品 含定量葉酸的標(biāo)準(zhǔn)乳粉（中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心），該乳粉標(biāo)稱含量為：126.0 μg/100g。

實驗方法 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制 以無菌水為稀釋液，按表1方法配置標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制方法

單因素試驗方法 提取溫度。準(zhǔn)確稱取1.0000g± 0.0005g樣品，將其加入50mL無菌離心管中，加入30mL磷酸鹽緩沖液，混勻，再用磷酸鹽緩沖液補至40mL。分別在60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴中提取30min，前3min每1min混勻一次，后每5min混勻一次（確保離心管密封），快速冷卻至30℃以下。在10000r/min下離心15min，然后在1.2mL無菌深孔板中對上清液進(jìn)一步稀釋。

提取時間。準(zhǔn)確稱取1.0000g±0.0005g樣品，將其加入50mL無菌離心管中，加入30mL磷酸鹽緩沖液，混勻，再用磷酸鹽緩沖液補至40mL。分別在100℃水浴中提取10min、20min、30min、40min、50min，前3min每1min混勻一次，后每5min混勻一次（確保離心管密封），快速冷卻至30℃以下。在10000r/min下離心15min，然后在1.2mL無菌深孔板中對上清液進(jìn)一步稀釋。

離心轉(zhuǎn)速。準(zhǔn)確稱取1.0000g±0.0005g樣品，將其加入50mL無菌離心管中，加入30mL磷酸鹽緩沖液，混勻，再用磷酸鹽緩沖液補至40mL。在100℃水浴中提取30min，前3min每1min混勻一次，后每5min混勻一次（確保離心管密封），然后快速冷卻至30℃以下。分別在 4000r/min、6000r/min、8000r/min、10000r/min、12000r/min下離心15min，然后在1.2mL無菌深孔板中對上清液進(jìn)一步稀釋。

檢測方法 在包被有鼠李糖桿菌的微孔板中加入葉酸培養(yǎng)基150μL，搖晃微孔板，使包被菌充分溶解在培養(yǎng)基中，再加入150μL標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液或待測樣品，每樣3孔，作3次平行，用粘合箔蓋住微孔條，用手將粘合箔平壓，使其充分封閉微孔板條，保證粘合箔和微孔的封閉性。37℃避光孵育48h。充分混勻培養(yǎng)物，使用酶標(biāo)儀在波長為630nm下測量OD值。以3孔OD值的平均值為該樣品的OD值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出該樣品的葉酸含量。取3次平行的結(jié)果為該處理方法的最終結(jié)果。計算其與標(biāo)示值的絕對差值Dx，Dx越小，表明結(jié)果越接近真值，該處理方式較合理。

結(jié)果與討論 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以葉酸含量為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，采用4次多項式回歸的方法，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。相關(guān)系數(shù)R2=0.9981，線性關(guān)系良好。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

提取溫度 在不同溫度下提取葉酸30min，10000r/ min離心處理后，所得葉酸結(jié)果如表3所示。從結(jié)果可以看出，隨著提取溫度的升高，Dx也減小，水浴溫度達(dá)到沸水?。?00℃）時，Dx最小，提示沸水浴可能是最適合的水浴條件。

表3 不同提取溫度下葉酸含量結(jié)果

提取時間 在沸水浴中以不同時間提取葉酸，然后經(jīng)10000r/min離心處理后，所得葉酸結(jié)果如表4所示。實驗結(jié)果表明，隨著提取時間的延長，Dx減小，在10min至30min間下降明顯，30min后，Dx下降趨緩。說明在沸水浴，離心轉(zhuǎn)速10000r/min下，水浴處理30min以上即可獲得較理想的實驗效果。

表4 不同提取時間下葉酸含量結(jié)果

離心轉(zhuǎn)速 在100℃下水浴30min后，以不同的離心轉(zhuǎn)速處理樣品液，所得葉酸結(jié)果如表5所示。實驗結(jié)果表明，隨著離心轉(zhuǎn)速的提高，Dx減小，在4000r/min到10000r/ min間降幅明顯，轉(zhuǎn)速超過10000r/min后，Dx基本不變，說明離心轉(zhuǎn)速越高，越有利于葉酸的檢測。

表5 不同離心轉(zhuǎn)速下葉酸含量結(jié)果

從整體來看，無論采用哪種處理條件，用微孔板法測定乳粉中的葉酸含量，Dx均為正數(shù)，即檢測結(jié)果偏高。其可能原因是微孔板法測定乳粉中葉酸含量的實質(zhì)是比濁測定，利用的是葉酸作為鼠李糖桿菌生長的必需營養(yǎng)素，鼠李糖桿菌生長繁殖速度與葉酸含量成正相關(guān)，表現(xiàn)為體系的濁度與葉酸含量成正相關(guān)的關(guān)系[11]。乳粉溶液是一種復(fù)雜的膠體分散體系，無機鹽在水中以溶解狀態(tài)存在，蛋白質(zhì)以膠體狀態(tài)懸浮在溶液中，脂肪形成乳濁液分散于乳中[12]。因此乳粉溶液本身存在較強的基質(zhì)干擾。消除基質(zhì)干擾的主要方法是沉淀體系中的大分子尤其是蛋白質(zhì)等。溫度提高和離心速率的提高都有利于體系中乳蛋白的沉淀[13]。此外，葉酸溶于熱水有一交換平衡過程，本實驗結(jié)果表明，40mL反應(yīng)體積大約需時為30min，30min后該交換基本達(dá)到平衡。離心轉(zhuǎn)速的提高不僅可以進(jìn)一步沉淀蛋白質(zhì)等物質(zhì)，還能使脂肪等成分上浮，脫離牛奶本體，使離心后的清液更接近于溶液，讓培養(yǎng)后的OD值更直觀地表現(xiàn)為微生物的生長情況。

前處理條件的控制對檢測乳粉中葉酸含量影響顯著。提取溫度、時間和離心轉(zhuǎn)速均對結(jié)果產(chǎn)生影響。其影響程度大致是離心轉(zhuǎn)速>提取時間>提取溫度。在沸水浴中，加熱30min，離心轉(zhuǎn)速為10000r/min的條件下處理，結(jié)果較理想。在該條件下，能在最大限度上減少基質(zhì)干擾，使乳粉中葉酸測定結(jié)果更接近真值，提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

□ 廣州甘蔗糖業(yè)研究所

廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室

國家糖業(yè)質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心

劉學(xué)文 高裕鋒 鄧倩南 陳海寧 林雅慧

余構(gòu)彬 郭劍雄 李海喬