西力扎提·阿不來提,楊旭超,木合布力·阿布力孜,任丙昭(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)有機教研室,烏魯木齊 830011)
?
HPLC法測定新疆脹果甘草全草中甘草查爾酮A的含量
西力扎提·阿不來提,楊旭超,木合布力·阿布力孜*,任丙昭(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)有機教研室,烏魯木齊830011)
摘要:目的對新疆脹果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat)全草中甘草查爾酮A(Lico A)進行含量測定。方法用HPLC法對脹果甘草根、莖和葉中Lico A的含量進行測定。色譜柱:依利特 Hypersil ODS2 C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)配預(yù)柱;流動相:甲醇-水-冰醋酸(60∶40∶1);流速:1.0 mL·min-1;柱溫:25 ℃;檢測波長:372 nm。結(jié)果Lico A質(zhì)量濃度在6.937 5~111 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 9);平均加樣回收率99.6%,RSD=1.5%;按此法測得的Lico A含量在根中為0.468%,莖中為0.254%,而在葉中未檢出。結(jié)論甘草查爾酮A在甘草中主要分布在根和莖中,莖也可作為獲取Lico A的新資源。
關(guān)鍵詞:新疆脹果甘草;甘草全草;甘草查爾酮A;高效液相色譜
甘草是豆科植物中的多年生草本植物之一,在我國被廣泛應(yīng)用和開發(fā)有4 000多年的歷史,被記錄在許多國家的藥典中,包括美國[1]、日本[2]和其他國家[3]。在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中至少70%的處方都含有甘草?!吨袊幍洹?2015年版一部)記載其原屬植物包括2種,即脹果甘草(GlycyrrhizainflataBat)和光果甘草(GlycyrrhizaglabraL.),其中脹果甘草在新疆地區(qū)資源分布較為多見[4]。甘草查爾酮A(Lico A)是一種含氧的查爾酮,也是脹果甘草的特異性成分之一,Lico A被認為是治療寄生蟲、 瘧疾和利什曼病[5-7]的潛在候選藥物[8]。Lico A具有抗炎、抗氧化、抗免疫力及抗腫瘤作用[9],具有比較良好的抗癌活性,諸多研究表明, Lico A顯示出較為明顯的抗前列腺癌和抗乳腺癌活性,并且能夠有效地抑制癌細胞在機體內(nèi)的擴散及轉(zhuǎn)移[10-13]。這些研究結(jié)果表明,甘草中的查爾酮類單體Lico A在抗癌創(chuàng)新藥物的研究中具有潛在的深入研究價值。然而,Lico A在脹果甘草中的含量很低,人工合成方法的工藝路線復(fù)雜,制備成本很高[14-15]。這促使人們?nèi)ふ襆ico A的新資源和新來源。我國學(xué)者崔永明等[14]早已建立了Lico A的HPLC含量測定方法,本文運用了此方法對脹果甘草全草各部位中Lico A的含量進行分析,并根據(jù)結(jié)果探討脹果甘草全草的綜合開發(fā)利用思路。
1儀器與試藥
1.1儀器LC-20AB泵,N-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司);AB104-N電子天平(Mettler-Toledo Group);高效液相色譜儀,SPD-20A紫外檢測器(日本島津公司);DT200型電子分析天平(常熟市衡器廠);SK2510HP型數(shù)控超聲清洗儀(上??茖?dǎo)超聲儀器有限公司)。
1.2試藥新疆脹果甘草(2014年8月分別采集自南疆地區(qū)的各個甘草基地,如新疆巴楚、新和、和田),用薄層方法鑒定為脹果甘草[16]。甲醇為色譜純;水為屈臣氏純凈水;Lico A對照品(美國Sigma公司,批號803529)質(zhì)量分數(shù)≥99%;無水乙醇、甲醇和冰醋酸均為分析純;蒸餾水為自制。
2方法與結(jié)果
2.1色譜條件色譜柱:Hypersil C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)配預(yù)柱;流動相:甲醇-水-冰醋酸(60∶40∶1);檢測波長:372 nm;流速:1.0 mL·min-1;柱溫:25 ℃。
2.2Lico A對照品溶液的制備稱取干燥恒質(zhì)量的Lico A對照品(120 ℃)11.1 mg,精密稱量,置于10 mL量瓶中,用體積分數(shù)為60%的甲醇溶液溶解配制成質(zhì)量濃度為1.11 mg·mL-1的溶液;從上述配液中精密吸取2 mL,置于10 mL量瓶中,用體積分數(shù)為60%的甲醇溶液溶解,配制成質(zhì)量濃度為0.222 mg·mL-1的對照品溶液。
2.3供試品溶液的制備分別稱取已粉碎好的甘草莖、根、葉20 g(過60目篩),置于250 mL圓底燒瓶中,加入甲醇溶液150 mL, 超聲處理30 min(功率400 W,頻率59 kHz),過濾,再加入甲醇100 mL,超聲處理30 min,兩者合并濾過,減壓并濃縮至干燥,精密稱取10.7 mg,置于10 mL量瓶中,加體積分數(shù)為60%的甲醇溶液溶解并定容至刻度,振蕩搖勻;經(jīng)微孔濾膜(孔徑為0.45 μm)濾過,棄去初濾液,得到續(xù)濾液,即供試品溶液。
2.4線性關(guān)系考察精密吸取Lico A對照品儲備液,質(zhì)量濃度由低到高配制成6.937 5,13.875,27.75, 55.5和111 μg·mL-1的溶液,依次分別進樣10 μL,按照上述色譜條件測定待測物的峰面積。以質(zhì)量濃度C(μg·mL-1)對主峰的峰面積(A)進行線性回歸,得回歸方程:Y=36 192X+30 278 (r=0.999 9),Lico A進樣量在6.937 5~111 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2.5精密度實驗精密吸取2.2項下的對照品溶液10 μL,在2.1項下的色譜條件下測定待測物的峰面積,連續(xù)進樣6次,結(jié)果顯示, 其精密度較為良好,Lico A的RSD為1.74%。
2.6重復(fù)性實驗取同一批次的樣品,按照2.3項下方法制備6份樣品溶液,在2.1項下的色譜條件下測定待測物的峰面積,結(jié)果顯示,甘草根部分中Lico A的平均含量為4.63 mg·g-1,RSD為1.84%,其重復(fù)性較為良好。
2.7穩(wěn)定性實驗精密吸取2.3項下同一供試品溶液,在2.1項色譜條件下測定峰面積,在0,2,4,8,12和24 h測定峰面積,其RSD為2.27%,研究表明,供試品溶液中的Lico A在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.8加樣回收率實驗取同一已知Lico A含量的供試品溶液6份約0.1 g,精密加入質(zhì)量濃度為0.41 mg·mL-1的Lico A對照品1 mL,按照2.3項下方法處理,得供試品溶液。按照標(biāo)準法進行測定并計算待測物的含量,結(jié)果見表1。
表1回收率實驗結(jié)果
Tab.1 The results of recovery test
(n=6)
2.9樣品測定分別精密稱取脹果甘草3個不同部位的樣品,按照2.3項下方法測定,計算Lico A的含量,結(jié)果表明,甘草根中Lico A的平均含量為0.468%,甘草莖中Lico A的平均含量為0.254%,而甘草葉中未檢出Lico A。
色譜圖見圖1。
圖 1 HPLC 圖
a.對照品;B.樣品;1.甘草查爾酮A
Fig.1 HPLC chromatograms
a. reference substances;B. sample;1. licochalcone A
3討論
Lico A是脹果甘草中的一種特異性成分,研究表明, Lico A具有明顯的抗前列腺癌和抗乳腺癌活性,并能抑制癌細胞的擴散轉(zhuǎn)移[10-13]。然而,脹果甘草中Lico A的含量很低,用化學(xué)方法人工合成使成本更高且工藝路線更復(fù)雜[14-15]。這促使人們尋找Lico A的新資源和新來源。
本實驗在文獻方法[14]的基礎(chǔ)上,優(yōu)化了實驗條件,并利用HPLC法對新疆脹果甘草全草進行Lico A的分布特征研究,并發(fā)現(xiàn)了全草中Lico A的新存在部位。首先分別對已鑒定的脹果甘草根、莖、葉用甲醇提取進行制備,然后利用HPLC法,以Lico A為對照品,用已有的色譜條件,以甲醇-水-冰醋酸(60∶40∶1)為流動相進行含量測定,結(jié)果脹果甘草根和莖中Lico A的含量分別為0.468%和0.254%,而甘草葉中沒有顯示出該特征峰。
新疆脹果甘草全草中查爾酮類活性成分Lico A的含量測定未見文獻報道,因此本研究結(jié)果具有重要意義。從脹果甘草中提取制備Lico A時,合理利用甘草莖,在保護甘草資源及甘草地上部分的綜合開發(fā)利用中具有一定的價值。本研究結(jié)果顯示,在抗癌活性成分Lico A新資源的研究中、促進脹果甘草莖的藥用開發(fā)利用中、甘草根資源保護中以及脹果甘草品種的快速鑒定研究中,將體現(xiàn)出其重要的意義。
參考文獻:
[1]The United States Pharmacopeial Convention. The United States Pharmacopeial Convention 37 [S]. USA, 2014: 1514.
[2]The Society of Japanese Pharmacopeia, The Japanese Pharmacopoeia16 [S]. The Society of Japanese Pharmacopeia, 2012: 1649-1650.
[3]Council of Europe. The European Pharmacopoeia 8.0 [S]. Strasbourg, Council of Europe. 2014: 1298-1299.
[4]國家藥典委員會.中國藥典2015年版[S]. 一部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社, 2015: 85-87.
[5]M Chen, S B Christensen, J Blom, et al. Licochalcone A, a novel antiparasitic agent with potent activity against human pathogenic protozoan species ofLeishmania[J].Antimicrob Agents Chemother, 1993, 37(12):2550-2556.
[6]M Chen, S B Christensen, T G Theander, et al. Antileishmanial activity of licochalcone A in mice infected withLeishmaniamajor and in hamsters infected withLeishmaniadonovani[J].Antimicrob Agents Chemother,1994, 38(6):1339-1344.
[7]M Chen, T G Theander, S B Christensen, et al. Licochalcone A, a new antimalarial agent, inhibits in vitro growth of the human malaria parasitePlasmodiumfalciparumand protects mice fromP.yoeliiinfection[J]. Antimicrob Agents Chemother,1994, 38(7): 1470-1475.
[8]L Zhai, J Blom, M Chen,et al. The antileishmanial agent licochalcone A interferes with the function of parasite mitochondria[J].Antimicrob Agents Chemother,1995,39(12):2742-2748.
[9]劉霞,謝建新,李艷,等.甘草多糖的超聲提取及含量分析[J].西北藥學(xué)雜志, 2004, 19(2): 60-61.
[10]Yi T Y, Gia S S, Keng F H, et al. Licorice and licochalcone-A induce autophagy in LNCaP prostate cancer cells by suppression of Bcl-2 expression and the mTOR pathway[J].J Agric Food Chem, 2009, 57: 8266-8273.
[11]Xiao X Y, Hao M, Yang X Y, et al. Licochalcone A inhibits growth of gastric cancer cells by arresting cell cycle progression and inducing apoptosis[J]. Cancer Lett , 2011, 302: 69-75.
[12]Kim J K, Shin E K, Park J H, et al. Antitumor and anti-metastatic effects of licochalcone A in mouse models [J]. J Mol Med, 2010, 88: 829-838.
[13]田莉,高曉黎.甘草的抗腫瘤作用[J].西北藥學(xué)雜志, 2004, 19(3): 133-135.
[14]崔永明,石月,陳悟,等.高效液相色譜法測定甘草中甘草查爾酮A的含量[J].時珍國醫(yī)國藥, 2009, 20(8): 2037-2038.
[15]陸文興,顏朝國,顧惠芬.查爾酮的KF-Al203催化合成[J].化學(xué)試劑,1995,17(4):253-254.
[16]木合布力,王永波,施翔弋,等.脹果甘草的簡便快速鑒定方法[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2014, 37(2): 151-154, 159.
Determination of licochalcone A in whole plant of XinjiangGlycyrrhizainflateby HPLC
Shirzat ABLAT, YANG Xuchao, Mourboul ABLISE*, REN Bingzhao(Department of Medicinal Chemistry, College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)
Abstract:Objective To measure the content of licochalcone A in the whole plant of Glycyrrhiza inflata Bat (GIB) from Xinjiang origin.Methods HPLC method was used to perform a quantitative analysis of licochalcone A content in the root, stem and leaves of GIB plant. Hypersil ODS2 C18column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) was used; the mobile phase was composed of methanol-water-glacial acetic acid (60∶40∶1) mixture , with a flow rate of 1.0 mL·min-1; the detection wavelength was 372 nm at 25 ℃. Results Licochalcone A was linear in the concentration range of 6.937 5-111 μg·mL-1(r=0.999 9); the average recovery rate was 99.6% with corresponding RSD of 1.5%. The content of licochalcone A in the root was 0.468%, and in the stem was 0.254%, however licochalcone A was not detected in the leaf. Conclusion Licochalcone A is mainly distributed in the root and stem of Glycyrrhiza inflata Bat. The stem may be a new resource of licochalcone A.
Key words:Glycyrrhiza inflata Bat;licorice whole plant; licochalcone A; HPLC
(收稿日期:2015-10-26)
*通信作者:木合布力·阿布力孜,男,博士,教授,博士生導(dǎo)師
作者簡介:西力扎提·阿不來提,男,在讀碩士研究生
基金項目:國家自然科學(xué)基金項目(編號:81260379)
中圖分類號:R927.2
文獻標(biāo)志碼:A
文章編號:1004-2407(2016)02-0130-03
doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.02.006