王嘉彬

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)

動物轉(zhuǎn)基因研究中鋅指核酸酶的應(yīng)用及進(jìn)展

王嘉彬

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)

作為一種比較先進(jìn)的基因修飾技術(shù)，鋅指核酸酶技術(shù)已經(jīng)在多種生物轉(zhuǎn)基因研究領(lǐng)域得到了應(yīng)用，包括植物、昆蟲、各類動物乃至人類細(xì)胞中，強(qiáng)化了人們對于動物復(fù)雜生理系統(tǒng)的理解和認(rèn)知，不僅使得鋅指核酸酶技術(shù)成為構(gòu)造轉(zhuǎn)基因生物的強(qiáng)力工具，更使得其在許多疾病的治療中發(fā)揮出了重要作用。本文主要對鋅指核酸酶在動物轉(zhuǎn)基因研究中的應(yīng)用及進(jìn)展進(jìn)行了討論。

動物轉(zhuǎn)基因；鋅指核酸酶；應(yīng)用；進(jìn)展

前言

轉(zhuǎn)基因在當(dāng)前的科學(xué)研究領(lǐng)域雖然并非新的課題，但是其受矚目的程度有增無減，主要是從特定生物體的基因組內(nèi)提取所需的目的基因，或者人工合成指定序列的DNA片段，將其轉(zhuǎn)入到生物體中，與生物體的基因組重組后，結(jié)合人工選育，獲得具有穩(wěn)定表現(xiàn)特定的遺傳性狀的個體，在新品種的培育方面意義重大。不過，常規(guī)意義上的轉(zhuǎn)基因一般是指植物，如水稻、玉米等，對于動物轉(zhuǎn)基因的研究尚屬于一個比較新穎的領(lǐng)域。

1　鋅指核酸酶概述

鋅指核酸酶（Zinc Finger Nuclease）屬于一種人工合成酶，其化學(xué)本質(zhì)為蛋白質(zhì)。鋅指核酸酶是一個由DNA識別結(jié)構(gòu)域以及非特異性核酸內(nèi)切酶的剪切結(jié)構(gòu)域融合而成的物質(zhì)，其N末端為鋅指蛋白DNA結(jié)構(gòu)域，包括了一系列的鋅指蛋白，每一個鋅指蛋白都能夠?qū)σ粋€特意的三聯(lián)體堿基進(jìn)行識別和結(jié)合；C末端為非特異性核酸酶剪切結(jié)構(gòu)域。相比較同源重組的DNA序列，鋅指核酸酶具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性，而且其內(nèi)部鋅指結(jié)構(gòu)和DNA強(qiáng)親和性的特點(diǎn)，使得鋅指核酸酶有著非常突出的特異性作用。

鋅指核酸酶技術(shù)憑借自身能夠特異性識別并切割DNA序列的特點(diǎn)，以及良好的可設(shè)計(jì)性，被用于基因的定點(diǎn)突變和外源基因的定點(diǎn)整合，是最近幾年發(fā)展起來的一種基因修飾技術(shù)。鋅指核酸酶技術(shù)能夠?qū)⒁粋€非特異性的核算內(nèi)切酶與含有鋅指的結(jié)構(gòu)域結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)對于特定序列的切割。理論上，可以利用這種技術(shù)對染色體特定片段的刪除，完成突變體的構(gòu)造或者疾病的治療［1］。

在不斷的研究過程中，鋅指核酸酶已經(jīng)被成功應(yīng)用于動植物的轉(zhuǎn)基因研究中，就實(shí)際效果而言，具有極高的基因整合效率。而在相關(guān)研究實(shí)驗(yàn)中，對特異性的鋅指蛋白（ZFP）進(jìn)行設(shè)計(jì)，是最為核心的內(nèi)容。在針對ZFP識別結(jié)構(gòu)域進(jìn)行設(shè)計(jì)時，存在兩種不同的思路，一是寡聚體庫工程法，其所構(gòu)建的鋅指核酸酶與靶DNA具有較高的親和性及特異性；二是模塊組裝法，即將能夠識別三個連續(xù)堿基的鋅指看作模塊，參照目標(biāo)序列，將不同的模塊拼接在一起。

2　鋅指核酸酶在動物轉(zhuǎn)基因研究中的應(yīng)用及進(jìn)展

經(jīng)過了大量的研究和試驗(yàn)，鋅指核酸酶技術(shù)在動物轉(zhuǎn)基因的研究中得到了成功應(yīng)用，取得了相當(dāng)顯著的進(jìn)展，其主要體現(xiàn)在以下兩個方面：

2.1基因定點(diǎn)敲除

在傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因研究中，采用的基因打靶技術(shù)雖然比較可靠，但是效率非常低下，在很大程度上阻礙了研究的進(jìn)展，而鋅指核酸酶技術(shù)（下文統(tǒng)稱ZFN）的出現(xiàn)，為動物轉(zhuǎn)基因的研究提供了一種相當(dāng)可靠的技術(shù)手段。

早在2001年，Bibikova等人就利用ZFN的特異識別性能，構(gòu)建了一個靶基因質(zhì)粒載體，這種載體與表達(dá)ZFN的質(zhì)粒共同注入到卵母細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)ZFN能夠切開靶基因，并利用同源重組對切口進(jìn)行修復(fù)。在這個研究的基礎(chǔ)上，他們又利用ZFN技術(shù)，敲除了X染色體上存在的yellow基因，同時發(fā)現(xiàn)這種變異可以非常穩(wěn)定的遺傳給后代。上述研究結(jié)果使得ZFN技術(shù)在動物轉(zhuǎn)基因的研究中的應(yīng)用成為了可能。

Meng等人在相關(guān)研究中，針對斑馬魚血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子受體基因，設(shè)計(jì)出了一種ZFN mRAN，將其注入到細(xì)胞期的斑馬魚胚胎中，能夠帶來極大的突變效率，雖然同樣存在有脫靶現(xiàn)象，但是相關(guān)的研究實(shí)驗(yàn)也從正面表明了可以通過注入mRNA的方式，實(shí)現(xiàn)基因打靶［2］。

利用專業(yè)打靶GGTA1基因，對半乳糖苷酶轉(zhuǎn)移酶的催化區(qū)域中的ZFN進(jìn)行編碼，可以得到相應(yīng)的突變個體，產(chǎn)生GGTA1基因敲除的母體，而通過將ZFN電轉(zhuǎn)染入雄體胚胎成纖維細(xì)胞的方式，同樣能夠?qū)崿F(xiàn)基因打靶，打靶效率在5.7%，產(chǎn)生GGTA1基因敲除的雄體，表明ZFN在雌雄細(xì)胞中都能夠起到相應(yīng)的基因敲除作用，從而為人類基因相關(guān)疾病的治療提供了一個良好的模型。

2.2基因定點(diǎn)重組

上述研究均表明，ZFN技術(shù)的應(yīng)用，能夠非常顯著的提升基因靶向敲除的效率，而事實(shí)上，其在動物轉(zhuǎn)基因中取得的進(jìn)展不止于此。最近的一些研究項(xiàng)目表明，ZFN技術(shù)在提高同源重組效率，實(shí)現(xiàn)基因定點(diǎn)重組方面同樣有著巨大的作用。

Porteus等人將預(yù)先構(gòu)建好的ZFN特異識別序列插入到GFP基因中，然后將其整合到了HEK293細(xì)胞中，形成了具備突變型GFP的HEK293穩(wěn)定細(xì)胞系，并利用連接在CMV啟動子上的ZFN表達(dá)質(zhì)粒以及表達(dá)野生型GFP同源供體質(zhì)粒，對穩(wěn)定細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)染。結(jié)果顯示，部分細(xì)胞中存在的突變GFP得到了修復(fù)，這也表明了ZFN技術(shù)可以在哺乳動物體細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)基因打靶。另外，2010年，Melanie等針對小鼠Rosa26基因，設(shè)計(jì)構(gòu)筑了一對ZFN，將潮霉素基因同源打靶載體、Venus同源打靶載體以及β-半乳糖苷酶分別與ZFN一起注射到了小鼠原核胚胎中，產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因小鼠，經(jīng)分析鑒定，同源打靶效率在1.7%-4.5%左右［3］。

3　結(jié)語

總而言之，大量的研究實(shí)驗(yàn)表明，鋅指核酸酶技術(shù)在動物轉(zhuǎn)基因研究中得到了成功應(yīng)用，取得了相當(dāng)?shù)某晒?，能夠在?xì)胞水平或個體水平上，進(jìn)行相應(yīng)的基因敲除和基因重組操作，從而為沒有獲得ES細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因動物提供了一種基因操作的可能性。雖然從目前來看，鋅指核酸酶技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用層面尚存在一些不足，但是相信經(jīng)過不斷的研究和探索，相關(guān)技術(shù)必然會愈發(fā)完善。

［1］劉曉，方永志，劉文浩，等.鋅指核酸酶技術(shù)在動物轉(zhuǎn)基因研究中的應(yīng)用［J］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，45（2）：135-138.

［2］王劉豪，王吉田，余昊，王運(yùn)兵.鋅指核酸酶技術(shù)在動物轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51（9）：4177-4180.

［3］袁玉國，彭秋玲.鋅指核酸酶技術(shù)在動物轉(zhuǎn)基因中的研究進(jìn)展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（8）：188-192.

王嘉彬（1995-），湖北鐘祥人，在讀學(xué)校：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，專業(yè)：動物科學(xué)。