江雄波，陳益嫻，張俊青，樊曉琳，閔水發(fā)，邊銀丙，范秀芝

（1．湖北生態(tài)職業(yè)技術學院，湖北 武漢 430200；2．華中農業(yè)大學應用真菌研究所，湖北 武漢 430070；3．湖北省農業(yè)科學院農產(chǎn)品加工與核農技術研究所，湖北 武漢 430064）

氮源比例和耳場條件對黑木耳膠原蛋白含量的影響*

江雄波1，陳益嫻1，張俊青2，樊曉琳2，閔水發(fā)1，邊銀丙2，范秀芝3**

（1．湖北生態(tài)職業(yè)技術學院，湖北 武漢 430200；2．華中農業(yè)大學應用真菌研究所，湖北 武漢 430070；3．湖北省農業(yè)科學院農產(chǎn)品加工與核農技術研究所，湖北 武漢 430064）

在黑木耳代料栽培基本配方中，采用不同比例的麥麩、豆餅粉和玉米粉為氮源，同時選擇露天水泥地、林下露地和林下蔭棚3種出耳場所，測定不同培養(yǎng)料配方和出耳場地條件下黑木耳冬耳和春耳中膠原蛋白含量。結果表明，溫度對黑木耳子實體中膠原蛋白合成具有促進作用，光照對膠原蛋白合成具有重要作用。不同氮源對子實體中膠原蛋白含量的影響存在差異，選擇10%麥麩、10%豆餅粉為氮源進行林下露地栽培，春季的耳片中膠原蛋白含量最高。

黑木耳；氮源；出耳場地；膠原蛋白；羥脯氨酸

膠原蛋白（collagen）因其獨特的生物相容、生物可降解、高拉伸強度、低免疫、止血以及促進細胞生長等功能，已被廣泛應用于食品、化妝品、臨床醫(yī)學和化工原料等產(chǎn)品[1-5]。受瘋牛病和口蹄疫等的影響，目前已有針對相對安全的黑木耳和榆耳膠原蛋白的研究[8-10]。

膠原蛋白廣泛存在于動物的結締組織及水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物中[1]，其中豬和牛的皮、骨頭，以及魚皮、魚骨、魚鱗等都是膠原蛋白的主要來源[6-7]。黑木耳（Auricularia auricula-judae）又名木耳、云耳和光木耳，含有豐富的蛋白質、多糖、維生素等營養(yǎng)物質，是一種重要的食（藥）用真菌。目前已從黑木耳中成功分離提取到膠原蛋白[8-9]，并比較了不同提取方法對膠原蛋白功能特性的影響[8]。本文主要研究培養(yǎng)料中不同氮源配比及出耳場所對黑木耳膠原蛋白含量的影響，尋找更適宜于黑木耳膠原蛋白合成的營養(yǎng)和環(huán)境條件，為利用黑木耳原料開發(fā)膠原蛋白產(chǎn)品奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株為黑木耳單片5號，由華中農業(yè)大學應用真菌研究所提供。

1.2 主要試劑與儀器設備

羥脯氨酸標準品，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；胰蛋白酶，biosharp公司（酶活為250 U·mg-1）產(chǎn)品；TYSP-200型高速萬能粉碎機，浙江省永康市紅太陽機電有限公司；超微量紫外/可見分光光度計，美國DeNovix公司。

1.3 培養(yǎng)料中氮源種類及組成

黑木耳代料栽培培養(yǎng)料基本配方為：闊葉樹雜木屑78%、麩皮20%、石膏1%、蔗糖1%。在基本配方中，設計6種替代20%麩皮作為氮源的配方，具體配方見表1。

表1 培養(yǎng)料配方Tab．1 Formulae of culture materials

原料混勻后調節(jié)含水量58%～62%，pH 6．0～6．5。采用聚乙烯塑料袋，大小15 cm×30 cm，按照常規(guī)方式進行制袋和接種[11]。試驗于2014年9月～翌年3月在湖北省大冶市楚林林場進行。菌袋制作時間2014年9月1日，11月1日進行刺孔，平均每個菌袋刺孔130個，于2014年12月10日開始催芽。

1.4 催芽與出耳管理

在3種不同出耳場所進行催芽與出耳處理。處理I為在露天水泥地上進行催芽和出耳管理，即在水泥地面上擺放菌袋。處理II為在林下露地催芽出耳，將刺孔后的菌袋放置在桂花樹、紅葉石楠組成的闊葉林苗圃地表面，菌袋上不覆蓋薄膜和稻草。處理III為林地蔭棚催芽出耳，先在闊葉林木苗圃地表面鋪1層稻草，將已刺孔的菌袋垂直擺放在稻草上面，菌袋之間相距2 cm～3 cm；在菌袋上方用竹片支起拱棚，拱棚高于菌袋5 cm～10 cm；覆蓋薄膜，薄膜上再蓋1層稻草；白天將稻草揭開，晚上再將稻草覆蓋保溫；每天中午12點～下午14點揭開薄膜，進行通風換氣。

根據(jù)菌袋表面干濕度適當噴水，保持空氣濕潤。按照出耳時間，分別采摘冬季和春季長出的黑木耳子實體，曬干后獲得冬耳和春耳產(chǎn)品。

1.5 黑木耳中膠原蛋白含量測定

1．5．1 黑木耳樣品的處理

0．05 mol·L-1氯胺T溶液、3．15 mol·L-1過氯酸、10%對二甲氨基苯甲醛溶液、羥脯氨酸標準貯存液和應用液的配制參照文獻[12]進行。

采摘不同編號的黑木耳子實體，用蒸餾水連續(xù)沖洗3次，30℃干燥烘干至恒重，分批粉碎后100目過篩。每個樣品稱量干重1．0 g，丙酮脫脂24 h，使丙酮揮發(fā)，冷卻45 min，干燥至恒重后將樣品溶解在（pH8）0．05 mol·L-1磷酸緩沖液中，加入8%（0．08 g）胰蛋白酶，使料液比為50∶1，酶解6 h，酶解結束后于12 000 r·min-1條件下離心15 min，吸取上清液10 mL，置于4℃冰箱里冷藏備用。

1．5．2 黑木耳中膠原蛋白含量測定

吸取上清液1 mL，加入0．05 mol·L-1氯胺T溶液氧化而形成吡咯環(huán)的氧化物，過氯酸終止氧化后用對二甲氨基苯甲醛作顯色劑，生成紅色化合物，在550 nm波長下進行比色測定。通過測定的羥脯氨酸含量計算得出膠原蛋白含量（C，%），計算公式為：

C=C1×V×N×X/M式中：C1表示羥脯氨酸的測定質量濃度；V表示上清液體積；N表示稀釋液倍數(shù)；X表示換算系數(shù)，參照哺乳動物中系數(shù)值，采用換算系數(shù)是7．46[13]；M表示稱重的黑木耳質量。

數(shù)據(jù)采用SPSS軟件處理分析[14]。

2 結果與分析

2.1 不同氮源對黑木耳膠原蛋白含量的影響

不同氮源對黑木耳膠原蛋白含量的影響見圖1。

由圖1可見，配方A所得冬耳中膠原蛋白含量明顯高于春耳，且在7個配方中，配方A（僅以豆餅粉為氮源）獲得的冬耳膠原蛋白含量最高（0．74%）；配方B（麥麩10%、豆餅粉10%）春耳膠原蛋白含量最高（0．94%），且是所有配方中膠原蛋白含量最高的。除配方A外，其它培養(yǎng)料中生長冬耳和春耳，均為春耳中膠原蛋白含量顯著高于冬耳。

圖1 不同氮源配方對黑木耳膠原蛋白含量的影響Fig．1 Effects of different nitrogen sources on collagen content of A.auricula-judae

2.2 不同耳場條件對黑木耳膠原蛋白含量的影響

不同耳場條件對黑木耳膠原蛋白含量影響見圖2。

圖2 不同耳場條件對黑木耳膠原蛋白含量的影響Fig．2 Effects of different fruiting environment on collagen content of A.auricula-judae

由圖2可見，不同栽培場所及管理方式下，所得膠原蛋白總量具有顯著差異，即林下露地＞林下蔭棚＞露天水泥地；不同栽培管理模式下，春耳中膠原蛋白含量顯著高于冬耳，冬耳和春耳中膠原蛋白含量差異趨勢相同；但在不同出耳場所及管理模式下，不同季節(jié)采摘的不同批次子實體中膠原蛋白含量差異無明顯規(guī)律性。

3 結論與討論

除配方A，6種氮源配方和3種耳場環(huán)境條件下所得春耳膠原蛋白含量顯著高于冬耳，推測溫度對膠原蛋白合成具有促進作用。

通過氮源配方試驗，推測不同氮源對黑木耳中膠原蛋白的合成具有調控作用，其中20%豆餅粉對不同季節(jié)采摘耳片膠原蛋白含量的影響表現(xiàn)出不同趨勢，推測可能與其培養(yǎng)料中較低碳氮比有關。在露天水泥地、林下露地和林下蔭棚3種耳場環(huán)境條件中，黑木耳在出耳過程中所接受的光照強度存在差異，即光照強度依次降低，所得黑木耳子實體中膠原蛋白含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，推測黑木耳膠原蛋白的合成還受光照調控，光照太強和太弱都會抑制膠原蛋白的合成。因此，通過本研究可知，為獲得膠原蛋白含量較高的黑木耳子實體，可選擇10%麥麩、10%豆餅粉為氮源，林下露地栽培，春季出耳。

綜上，本研究通過不同培養(yǎng)基質的篩選和配套栽培管理措施的選擇來提高營養(yǎng)或活性成分的含量，并為以黑木耳為原料生產(chǎn)膠原蛋白應用于食品、化妝品、醫(yī)療保健等領域奠定理論基礎。

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Effects of Nitrogen Source and Fruiting Environment on Collagen Content of Auricularia auricula-judae

JIANG Xiong-bo1,CHEN Yi-xian1,ZHANG Jun-qing2,FAN Xiao-lin2, MIN Shui-fa1,BIAN Yin-bing2,FAN Xiu-zhi3
(1．Hubei Ecology Technical College,Wuhan 430200,China;2．Insistute of Applied Mycology,Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070,China;3．Institute of Agro-Products Processing and Nuclear-Agricultural Technology,Hubei Academy of Agricultural Sciences,Wuhan 430064,China)

The collagen content of Auricularia auricula-judae picked at winner and spring,with different proportion of wheat bran,bean cake powder and corn flour as nitrogen sources and cultivated open or shed under the forest and open-air,were determined．The results showed that the temperature during the fruiting had a role promotion effect on collagen synthesis,and the light showed significant effect on the synthesis．The effect of nitrogen sources on collagen content was different．In this paper, using 10%wheat bran and 10%soybean meal as nitrogen source,open culture under forest,picking at spring,it can get fruiting bodies with highest collagen content．

Auricularia auricula-judae;nitrogen source;fruiting field;collagen;hydroxyproline

S646.9

A

1003-8310（2016）01-0050-03

10．13629/j．cnki．53-1054．2016．01．014

中央財政林業(yè)科技推廣示范項目（HBTG02）。

江雄波（1975-），男，本科，高級工程師，主要從事林業(yè)經(jīng)濟作物栽培研究。E-mail:stxycyb＠163．com

**通信作者：范秀芝（1984-），女，博士，助理研究員，主要從事食用菌活性物質代謝調控及功能食品開發(fā)研究。E-mail:xzhfan＠aliyun．com

2015-11-15