宗方方，　譚　俊，　邵　雷，　陳代杰*

1.上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234； 2.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院 創(chuàng)新藥物與制藥工藝國家重點實驗室，上海 201203

腸道菌群調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)增強腫瘤治療效果

宗方方1,2，譚俊2，邵雷2，陳代杰2*

1.上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234； 2.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院 創(chuàng)新藥物與制藥工藝國家重點實驗室，上海 201203

摘要：人體健康與腸道菌群息息相關(guān)，越來越多的研究顯示正常菌群不僅在消化、免疫等方面有諸多不可替代的作用，腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變與失衡更是與肥胖、糖尿病、心腦血管疾病、腫瘤等多種疾病密切相關(guān)。最新研究表明藥物刺激免疫系統(tǒng)引起的抗腫瘤免疫反應(yīng)以及自身免疫反應(yīng)都離不開腸道菌群的參與，腸道菌群能夠通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)增強腫瘤治療效果。

關(guān)鍵詞：腸道菌群； 人體健康； 免疫反應(yīng)； 腫瘤治療

腸道菌群是一個獨特多樣的生態(tài)系統(tǒng)，其種類超過1000種，細(xì)胞總數(shù)高達(dá)1014，是已發(fā)現(xiàn)的生態(tài)系統(tǒng)中細(xì)胞密度較高的系統(tǒng)之一[1]。種類繁多的腸道菌群不僅能實現(xiàn)自身間物質(zhì)及信息交換，且能與宿主細(xì)胞之間不斷地進行信息交流、參與宿主代謝、生理性地調(diào)控重要化學(xué)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。腸道菌群在宿主體內(nèi)扮演著非常重要的角色，越來越多的研究證實人體健康與腸道菌群息息相關(guān)，不僅在消化、免疫等方面有諸多不可替代的作用，更是與肥胖[2-4]、糖尿病[5-7]、心腦血管疾病[8，9]、艾滋病[10]、癌癥[11-13]等多種疾病密切相關(guān)。最新的研究表明：腸道菌群能夠通過調(diào)解腫瘤微環(huán)境中抗腫瘤相關(guān)免疫反應(yīng)，從而增強抗癌藥物的治療效果[14-19]。

1腸道菌群增強小分子類藥物的腫瘤治療效果

1.1鉑類化合物

鉑類藥物是迄今為止應(yīng)用最廣泛的抗腫瘤藥之一。自1979年第一個鉑類藥物順鉑問世以來，鉑類藥物為許多腫瘤的化療提供了有力的武器。由于順鉑的毒性及耐藥性，驅(qū)使一系列毒性或耐藥性更小的鉑類抗腫瘤藥在此基礎(chǔ)上產(chǎn)生，至今為止已有5種鉑類藥物成功上市，其中卡鉑和奧沙利鉑在全球廣泛應(yīng)用，奈達(dá)鉑、洛鉑、庚鉑在亞洲部分地區(qū)得以上市應(yīng)用。

Iida等人[14]研究證實腸道菌群可以增強鉑類等化療藥物對腫瘤的治療效果。Iida等人將小鼠的飲水中加入萬古霉素、亞胺培南和新霉素組成的抗生素混合物(ABX)，三周后向小鼠皮下注射EL4及MC38腫瘤細(xì)胞，當(dāng)腫瘤直徑大于4毫米時采用鉑類藥物對小鼠進行化療。研究結(jié)果顯示奧沙利鉑可以根除荷瘤小鼠體內(nèi)絕大多數(shù)皮下腫瘤，從而延長小鼠的存活時間，經(jīng)過抗生素ABX處理后，明顯減慢了小鼠體內(nèi)腫瘤的衰亡，降低了小鼠的存活率。經(jīng)過抗生素ABX處理同樣也降低了順鉑對EL4腫瘤細(xì)胞的治療效果。GF小鼠(無菌小鼠)實驗也證實缺少腸道菌群會降低鉑類化合物對腫瘤治療的效果。Iida等人[14]通過基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，鉑類化合物的抗腫瘤作用并不依賴腫瘤壞死因子，而是通過產(chǎn)生活性氧簇(ROS)從而引起DNA損傷及細(xì)胞凋亡。在經(jīng)ABX處理小鼠或GF小鼠中，腸道菌群的缺失引起ROS產(chǎn)生減少及細(xì)胞毒性的降低，導(dǎo)致鉑類化合物對腫瘤細(xì)胞治療效果減弱。

1.2環(huán)磷酰胺

環(huán)磷酰胺(CTX)是一種有效的烷基化抗腫瘤藥物，是目前臨床上重要的抗腫瘤藥物之一。它能夠誘導(dǎo)免疫原性腫瘤細(xì)胞死亡，破壞免疫抑制性T細(xì)胞，協(xié)助Th1和Th17細(xì)胞控制腫瘤細(xì)胞增殖。

Viand S等人[15]通過小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷酰胺能夠激發(fā)小腸內(nèi)某些特定的革蘭氏陽性菌遷移，從而引起小腸菌群的顯著改變。Sophie Viaud等人通過高通量焦磷酸測序和QPCR分析了腸道菌群的整體組成，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過環(huán)磷酰胺治療后的荷瘤小鼠小腸內(nèi)細(xì)菌總數(shù)及柔嫩梭菌的數(shù)目都沒有改變，但會導(dǎo)致約氏乳桿菌、鼠乳桿菌、海氏腸球菌等減少，并向二級淋巴器官發(fā)生選擇性遷移。同時通過流式細(xì)胞儀組織分離和原位免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，服用環(huán)磷酰胺后引起菌群失調(diào)的同時，小腸固有層中CD103+CD11b+樹突細(xì)胞及αβ(TCRαβ)+CD3+T細(xì)胞分泌轉(zhuǎn)錄因子RORγ t的能力明顯減弱。環(huán)磷酰胺治療后的SPF小鼠(無特定病原體小鼠)脾細(xì)胞體外釋放IL-17(白介素-17)增加，而在GF小鼠中未能得到此結(jié)果。研究顯示在使用廣譜抗生素(粘菌素、氨芐西林、鏈霉素等聯(lián)合用藥)處理腸道后，也抑制了脾細(xì)胞對IL-17和IFNγ的環(huán)磷酰胺刺激性分泌。用萬古霉素和革蘭氏陽性菌特異性抗生素治療小鼠同樣減少了環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)型TH17細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。Sophie Viaud等人進一步研究發(fā)現(xiàn)在二級淋巴器官中，這些腸道細(xì)菌能夠刺激“病原性”輔助T細(xì)胞17(pTH17)和TH1記憶細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)，而荷瘤無菌小鼠或經(jīng)抗生素作用殺死革蘭氏陽性菌的荷瘤小鼠的pTH17細(xì)胞特異性免疫反應(yīng)明顯減弱，且腫瘤細(xì)胞對環(huán)磷酰胺表現(xiàn)出耐受。然而，通過pTH17細(xì)胞轉(zhuǎn)移之后又部分恢復(fù)了無菌小鼠及抗生素處理小鼠體內(nèi)環(huán)磷酰胺的抗腫瘤作用[16]。這些結(jié)果表明腸道微生物能夠調(diào)節(jié)環(huán)磷酰胺引發(fā)的宿主免疫反應(yīng)，從而增強環(huán)磷酰胺抗腫瘤治療效果。

1.3CpG寡核苷酸

免疫系統(tǒng)通過高度保守的受體識別病原體，從而激活機體的固有免疫以及獲得性免疫應(yīng)答。Toll樣受體(TLR)是目前研究最清楚的受體之一，共有10個分子家族。CpG寡核苷酸(CpG-ODN)是TLR9受體激動劑，能夠直接誘導(dǎo)漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDC)的活化和成熟，促進Th1型細(xì)胞因子的分泌及抗原提呈細(xì)胞(APC)的成熟和活化，具有激活機體免疫系統(tǒng)的作用。

Iida等人[14]向荷瘤小鼠體內(nèi)連續(xù)三周給藥ABX，當(dāng)腫瘤直徑大于4毫米時對小鼠進行CpG-ODN免疫治療。腫瘤基因表達(dá)分析結(jié)果顯示經(jīng)抗生素處理，小鼠體內(nèi)與炎癥反應(yīng)、吞噬作用、抗原提呈及適應(yīng)性免疫反應(yīng)有關(guān)的基因下調(diào)，而與組織發(fā)育、惡性腫瘤和新陳代謝相關(guān)的基因上調(diào)?？股刈饔蔑@著破壞了小鼠腫瘤細(xì)胞中CpG-ODN誘導(dǎo)型Tnf的表達(dá)及白細(xì)胞產(chǎn)生的頻率，同時降低了某些免疫細(xì)胞中細(xì)胞因子的數(shù)量及腫瘤相關(guān)樹突細(xì)胞中CD86的表達(dá)及IL-12B的產(chǎn)生。為了確定ABX的作用效果是否與減少細(xì)菌負(fù)荷量有關(guān)，Iida等人隨后采用GF荷瘤小鼠及SPF荷瘤小鼠分別接受CpG-ODN治療。結(jié)果表明GF小鼠對CpG-ODN的治療反應(yīng)明顯減弱，腫瘤壞死因子(TNF)和IL-12B的產(chǎn)生量顯著降低。進一步研究發(fā)現(xiàn)灌胃給藥細(xì)菌脂多糖(LPS)可以很大程度上修復(fù)ABX處理后野生型小鼠腫瘤細(xì)胞中的Tnf的表達(dá)及白細(xì)胞產(chǎn)生的頻率，但是在Tlr4缺失型小鼠中未產(chǎn)生這種效果，Tlr4缺失反而會導(dǎo)致免疫治療后Tnf感應(yīng)減弱及腫瘤細(xì)胞退化降低[14]。這些研究結(jié)果表明，細(xì)菌產(chǎn)物(如LPS)經(jīng)過TLR4活化后直接或間接誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)骨髓細(xì)胞對CpG-ODN的免疫應(yīng)答，腸道菌群數(shù)量的減少影響CpG-ODN抗腫瘤免疫反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致CpG-ODN腫瘤治療效果減弱。

2腸道菌群增強檢測點抑制劑及抗體類藥物的腫瘤治療效果

2.1CTLA-4檢測點抑制劑

CTLA-4(即細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)蛋白-4)是一種T淋巴細(xì)胞負(fù)調(diào)節(jié)器，影響人體的免疫系統(tǒng)，削弱其殺死癌細(xì)胞的能力，是目前研究最熱的癌癥免疫治療靶點[16]。美國FDA于2011年批準(zhǔn)免疫檢查點抑制劑Ipilimumab上市，用于治療晚期黑色素瘤。Ipilimumab能與CTLA-4結(jié)合并有效阻滯CTLA-4與其配體CD80/CD86的相互作用，增加T細(xì)胞的活化和增殖。然而一些臨床結(jié)果表明僅有20%的黑色素瘤患者經(jīng)過Ipilimumab治療后獲得了壽命的延長。

Zitvogel[17]認(rèn)為Ipilimumab能夠引發(fā)潰瘍并引起腸道內(nèi)一部分細(xì)菌的死亡，這一副作用暗示Ipilimumab的藥效可能與腸道微生物有很大關(guān)系，腸道內(nèi)某一特定類型的細(xì)菌可能參與了微生物的抗腫瘤效應(yīng)。為了驗證這一猜想，Zitvogel等人[17]通過小鼠黑色素瘤模型及MC38腫瘤模型研究發(fā)現(xiàn)抗CTLA-4抗體藥物能夠抑制SPF小鼠中腫瘤細(xì)胞的生長，而在GF小鼠中未表現(xiàn)這種作用。向小鼠給藥廣譜抗生素混合物(ACS，即氨芐西林、粘菌素、鏈霉素聯(lián)合用藥)及亞胺培南單獨用藥也會造成抗CTLA-4抗體藥物治療效果減弱。這些結(jié)果表明Ipilimumab等抗CTLA-4抗體藥物發(fā)揮抗癌作用需要腸道菌群的幫助。采用16S rRNA高通量基因測序分析發(fā)現(xiàn)，抗CTLA-4抗體藥物能夠引起腸道菌群的明顯改變，CTLA-4封鎖導(dǎo)致小鼠糞便中擬桿菌屬和伯克氏菌屬數(shù)量減少。采用QPCR對小腸粘膜及糞便中擬桿菌屬進行分析顯示接受抗CTLA-4抗體藥物后擬桿菌屬相對豐度呈減少趨勢，而小腸粘膜中某些特殊種屬，如多形擬桿菌及單行擬桿菌相對豐度提高。隨后Zitvogel等人將特定的微生物種群如多形擬桿菌、脆弱擬桿菌等定植到經(jīng)ACS處理小鼠及GF小鼠腸道內(nèi)部，結(jié)果顯示腸道菌群的再生能夠恢復(fù)抗CTLA-4抗體藥物的抗腫瘤效果。同樣，通過向抗CTLA-4抗體藥物治療的GF小鼠口服喂食脆弱擬桿菌可以提高其淋巴腫瘤細(xì)胞中Th1免疫應(yīng)答，促進樹突細(xì)胞的成熟及分化。這些研究結(jié)果表明擬桿菌屬在調(diào)節(jié)CTLA-4檢測點抑制劑抗腫瘤免疫刺激中起到關(guān)鍵作用。

2.2抗PD-1/PD-L1抗體類藥物

腫瘤逃逸是目前腫瘤免疫治療公認(rèn)的障礙，已有研究表明程序性死亡配體-1(PD-L1)與腫瘤的免疫逃逸機制有關(guān)。癌細(xì)胞能夠在自身表面產(chǎn)生PD-L1，與T細(xì)胞表面的細(xì)胞膜蛋白受體PD-1結(jié)合，PD-1/ PD-L1信號通路的激活可導(dǎo)致免疫抑制性腫瘤微環(huán)境形成，使腫瘤細(xì)胞逃避機體免疫監(jiān)視和殺傷，從而促進腫瘤的發(fā)生與生長[18]。因此，采用抗PD-1/PD-L1抗體類藥物阻斷PD-1/PD-L1信號通路可以逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫微環(huán)境，增強內(nèi)源性抗腫瘤免疫效應(yīng)。

Sivan A等人[19]最新研究表明抗PD-L1抗體抗腫瘤作用存在個體差異可能與個體之間的腸道微生物組成存在差異密切相關(guān)。 Sivan A等人選用了分別來自Jackson實驗室(JAX)和Taconic農(nóng)場(TAC)的攜有不同共生微生物群的同一品系小鼠，比較它們皮下黑色素瘤的增長。研究發(fā)現(xiàn)JAX小鼠體內(nèi)黑色素瘤的生長速度明顯慢于TAC小鼠，而經(jīng)過共同飼養(yǎng)后消除了兩種小鼠在腫瘤生長和免疫應(yīng)答反應(yīng)之間的差異，由此表明腸道微生物菌群差異能影響小鼠抗腫瘤免疫反應(yīng)。且JAX小鼠體內(nèi)自身特異性T細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)和瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞積累明顯高于TAC小鼠，表明兩種小鼠抗腫瘤免疫反應(yīng)之間的差異是由免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的[19]。為了確定與增強抗腫瘤免疫反應(yīng)有關(guān)的特定細(xì)菌，Sivan A等人考察了隨著時間的推移小鼠糞便中細(xì)菌含量，比較分析TAC小鼠和JAX小鼠257種菌群的相對豐度，雙歧桿菌是與腫瘤微環(huán)境中活性特異性抗原T細(xì)胞積累有明顯關(guān)聯(lián)的唯一關(guān)鍵菌群，經(jīng)鑒定此類雙歧桿菌中主要是短雙歧桿菌、長雙歧桿菌和青春雙歧桿菌，且要達(dá)到抗腫瘤效果需要活細(xì)菌，因此事先服用熱失活的雙歧桿菌并不會增強腫瘤的治療效果。Sivan A等人[19]研究表明植入特定菌群與用抗PD-1/PD-L1抗體治療小鼠均可減緩腫瘤的生長，特定菌群與抗PD-1/PD-L1抗體聯(lián)合作用顯著增強了腫瘤治療效果。通過大規(guī)模測試發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌能夠通過與漫游的樹突狀細(xì)胞相互作用觸發(fā)免疫反應(yīng)，激活腫瘤殺傷性T細(xì)胞。這些研究表明抗PD-1/PD-L1抗體抗腫瘤作用存在個體差異，可能與個體之間的腸道微生物組成存在差異密切相關(guān)，雙歧桿菌能夠促進抗腫瘤免疫反應(yīng)，增強抗PD-1/PD-L1抗體抗腫瘤作用。

3展望

人類腸道是一個巨大而又復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，在人類的生存中具有十分重要的作用。很早以前，人們就已經(jīng)意識到了腸道內(nèi)與人體共生的微生物對于人體健康具有極大的影響力。近年來腸道微生物與免疫系統(tǒng)之間的聯(lián)系引起了越來越多研究人員的密切關(guān)注,且越來越多的研究表明腸道菌群與抗腫瘤免疫反應(yīng)息息相關(guān)。利用腸道微生物與免疫系統(tǒng)之間的聯(lián)系，通過選擇性調(diào)節(jié)腸道細(xì)菌來改善免疫療法將成為腫瘤治療的一條新途徑。

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Intestinal flora enhance tumor therapeutic effects by modulating immune responses

ZONG Fang-fang1,2, TAN Jun2, SHAO Lei2, CHEN Dai-jie2

1. College of Life and Environment Science, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China; 2. State Key Laboratory of New Drug and Pharmaceutical Process, Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, China State Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai 201203, China

AbstractHuman health is related to intestinal flora closely, more and more studies showed that the normal flora played an important role in terms of digestion, immunity, obesity, diabetes, cardiovascular disease, cancer and many other diseases. Recent studies showed that chemotherapy drugs stimulated antitumor immune responses and autoimmune responses required the participation of intestinal flora. The intestinal microbiota could affect the therapeutic effects by modulating the immune responses effects.

Key wordsintestinal microbiota; human health; immune responses; oncotherapy

基金項目：國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(No.2013ZX09301302，No.2014ZX09507009-025)國家自然科學(xué)基金(No. 81573329)。

作者簡介：宗方方(1991～)，女，在讀碩士研究生。E-mail：elvazong@163.com。 *通訊作者：陳代杰，男，研究員。E-mail：hccb001@163.com。