于云娟，　李兆坤，　劉　妍，　續(xù)丹丹，　王鳳寰

北京工商大學(xué)，北京 100048

新型復(fù)合誘變法篩選高產(chǎn)1,3-丙二醇菌株

于云娟，李兆坤，劉妍，續(xù)丹丹，王鳳寰*

北京工商大學(xué)，北京 100048

摘要：為提高肺炎克雷伯氏菌生產(chǎn)1,3-丙二醇的能力，使用一種新型的以氮?dú)鉃楣ぷ鳉怏w的等離子體復(fù)合紫外的誘變系統(tǒng)(MPMS-UV)對(duì)菌種進(jìn)行誘變。用含有90 g/L ～100 g/L 1,3-丙二醇的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選馴化，最終獲得一株高產(chǎn)PDO且甘油利用率高的優(yōu)良菌株k2。2 L批式流加發(fā)酵結(jié)果表明，該菌株P(guān)DO產(chǎn)量為69.71 g/L，摩爾產(chǎn)率為0.57 mol/mol，比原始菌株分別提高了44.7%和21%。

關(guān)鍵詞：1,3-丙二醇； 紫外復(fù)合等離子體誘變系統(tǒng)； 發(fā)酵

1,3-丙二醇(PDO)是聚對(duì)苯二甲酸丙二醇酯(PTT)的合成前體。PTT是一種新型的聚酯纖維材料。作為時(shí)裝材料，PTT具有良好的伸展性、柔韌性、抗皺性及易加工性，因此在服裝材料領(lǐng)域有巨大的市場前景。目前全球65%的PDO是采用化學(xué)法合成[1]，但化學(xué)合成法存在一些問題：對(duì)設(shè)備有高壓和高溫的要求、反應(yīng)過程中需使用昂貴的催化劑、釋放有毒的中間體、依賴不可再生材料、低產(chǎn)量和復(fù)雜性等[2]。1881年Fzeund提出了甘油發(fā)酵PDO，之后由于生物法發(fā)酵PDO成本低、污染少、條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，得到了大家廣泛的認(rèn)可[3]。Du Pont利用基因工程手段獲得工程菌E.coli，以葡萄糖為初始底物發(fā)酵生產(chǎn)PDO[4]，并取得了很大的進(jìn)展，處于世界領(lǐng)先水平；我國雖然起步較晚，但發(fā)展非?？?。盛虹集團(tuán)與清華大學(xué)合作開發(fā)，采用生物柴油副產(chǎn)物甘油作為主要原料，5萬噸/年項(xiàng)目于2013年 5月開工建設(shè)[5]。

采用微生物法生產(chǎn)PDO關(guān)鍵在于菌株。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumonia)產(chǎn)PDO能力強(qiáng)，周期短，效率高，是現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)。但是該菌株存在底物和產(chǎn)物抑制的問題[6]，這是利用微生物法發(fā)酵PDO難題的關(guān)鍵之一。目前獲得優(yōu)良菌株的方法包括用基因工程手段來定向改造菌株代謝途徑[7]；利用物理、化學(xué)手段對(duì)菌株進(jìn)行誘變。常用的物理方法有紫外誘變、等離子體誘變等；常用的等離子體誘變包括介質(zhì)阻擋放電等離子體[8]、常溫常壓等離子體ARTP等，本實(shí)驗(yàn)所采用的是一種新型的物理方法——紫外復(fù)合等離子體誘變方法(MPMS-UV)。MPMS所使用的工作氣體是氮?dú)猓〈薃RTP所使用的高成本的氦氣，同時(shí)結(jié)合紫外照射，這樣可以有效增加突變率；同時(shí)也具有操作簡單、成本低、無毒無害等特點(diǎn)，是一種適合現(xiàn)代工業(yè)需求的育種方法。實(shí)驗(yàn)使用紫外復(fù)合等離子體來誘變菌株，經(jīng)過多次篩選、馴化和發(fā)酵最終挑選出優(yōu)良菌株，為將來發(fā)酵PDO提供良好菌株和為發(fā)展等離子體誘變系統(tǒng)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

菌株：肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniakp-13(由北京生物加工過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供)

主要試驗(yàn)儀器：恒溫?fù)u床(太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)，恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)實(shí)驗(yàn)有限公司)，多功能等離子體誘變系統(tǒng)(北京艾德豪克國際技術(shù)有限公司)，高效液相色譜(島津有限公司)，2L全自動(dòng)發(fā)酵罐(鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)公司)。

種子培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，NaCl 5，酵母粉 5，pH 7.0。

選擇培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，NaCl 5，酵母粉 5，PDO 90/100，瓊脂 15(固體)，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：K2HPO4·3H2O 3.4，KH2PO41.3，(NH4)2SO44，MgSO40.24，CaCl20.1，葡萄糖 2.5，酵母粉 3，甘油 20，富馬酸 0.025，微量元素 1mL，pH 7.0。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)條件

搖瓶培養(yǎng)條件：250 mL搖瓶裝液量100 mL，接種量1%，溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)時(shí)間10 h。

發(fā)酵罐培養(yǎng)條件：初始發(fā)酵培養(yǎng)液體積1.6 L，接種量10%，發(fā)酵溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速300 r/min，初始甘油濃度25 g/L，補(bǔ)料液配方：70%甘油、10%葡萄糖、20%水，用4 mol/L KOH調(diào)節(jié)pH為7.0，發(fā)酵時(shí)間30 h。

1.2.2誘變處理

等離子體誘變參數(shù)：99.99%及以上氮?dú)?，氣體流量12.05 slpm，誘變距離20 mm，溫度25 ℃，垂直照射；紫外誘變：距離30cm，波長254 nm，功率300 W，斜45°照射。

將原始菌株活化傳代2次后接種于100 mL的搖瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，待菌體生長到對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行稀釋，稀釋到大約108個(gè)/mL，菌懸液制備完畢。取制備好的菌懸液15 μL，放入誘變系統(tǒng)中，打開紫外燈并注入氮?dú)馔瑫r(shí)進(jìn)行誘變。誘變的時(shí)間選取致死率為95%左右的時(shí)間點(diǎn)。復(fù)合誘變后，將菌液從處理室取出，稀釋適當(dāng)倍數(shù)涂布于1,3-丙二醇濃度為90 g/L的選擇培養(yǎng)基平板上在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.3菌種篩選與馴化

挑取在選擇培養(yǎng)基中體積較大長勢較好的菌落，劃線到PDO濃度為100 g/L的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行二次篩選，將體積長勢較好的菌落轉(zhuǎn)接到與選擇培養(yǎng)基相同濃度PDO的搖瓶中多次培養(yǎng)馴化?？疾旄鲹u瓶菌株的生物量、產(chǎn)物濃度，最后挑選最優(yōu)菌株進(jìn)行發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)[7, 9]。

1.2.4發(fā)酵實(shí)驗(yàn)及發(fā)酵參數(shù)測定

篩選后的優(yōu)良菌株進(jìn)行2 L補(bǔ)料批式發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，每2 h取樣1次，在600 nm下測定吸光值，測定甘油濃度，根據(jù)所得甘油濃度調(diào)節(jié)補(bǔ)料流加速度，使罐內(nèi)甘油濃度保持在15 g/L ～20 g/L。發(fā)酵完畢后用高效液相色譜測定發(fā)酵液中底物、代謝產(chǎn)物等有效成分的含量。實(shí)時(shí)測量發(fā)酵罐內(nèi)甘油含量采用高碘酸鈉氧化法；產(chǎn)物濃度使用島津高效液相色譜分析，檢測器為RID示差檢測器，色譜柱為Bio-Rad 公司Amines HPX-87H 有機(jī)酸離子交換柱，柱溫65 ℃，流動(dòng)相為 5 mmol/L H2SO4，流速為0.6 ml/min。樣品分析前經(jīng)0.45 μm 微濾膜過濾。

2結(jié)果與討論

2.1誘變致死率

對(duì)菌株進(jìn)行不同時(shí)間的復(fù)合誘變，計(jì)算致死率，結(jié)果如表1所示。隨著誘變時(shí)間增加，致死率也增加，當(dāng)誘變時(shí)間為40 s時(shí)致死率為100%，誘變20 s時(shí)致死率為93%，因此選擇誘變時(shí)間20 s。

表1　復(fù)合誘變致死率

2.2搖瓶發(fā)酵

第一次使用PDO濃度為90 g/L的平板初步篩選出25個(gè)菌落體積較大的菌株，將這25個(gè)菌落涂布于PDO濃度為100 g/L的平板上復(fù)篩。有8個(gè)菌落體積較大，長勢良好，將這8株菌命名為k1-k8。經(jīng)傳代馴化搖瓶培養(yǎng)后，突變菌株的生物量與PDO含量均比原始菌株高，其中 k2、k4、k7的生物量和PDO的含量明顯高于其他突變菌(圖1)，OD值分別為6.85、6.89、6.98；PDO分別為11.212 g/L、10.812 g/L、12.013 g/L；k7的生物量和PDO的含量是最高的。

圖1　誘變后各搖瓶生物量及PDO含量

K.pneumonia甘油代謝途徑包括還原途徑和氧化途徑，PDO代謝屬于還原途徑；氧化途徑會(huì)產(chǎn)生一些主要的副產(chǎn)物，如乙酸、乳酸、乙醇等(圖2)，這些副產(chǎn)物的合成過程會(huì)對(duì)主產(chǎn)物PDO的合成造成一定影響。由于副產(chǎn)物乙酸不消耗NADH，并且提供ATP，因此乙酸的合成有利于合成PDO；而副產(chǎn)物乳酸、乙醇等消耗NADH，與PDO形成競爭關(guān)系，因此乳酸與乙醇等的合成不利于PDO的合成。對(duì)于k2和k4，由圖3看出，k2的 pH值下降較k4多，表明產(chǎn)酸較k4多，由此可以推斷PDO產(chǎn)量可能會(huì)較多。另從圖4看到，k2甘油的消耗量也較k4多，表明k2菌株的性能可能優(yōu)于k4。

①甘油脫水酶(GDHt)；②1,3-丙二醇氧化還原酶(PDOR)；③甘油脫氫酶(GDH)；④二羥基丙酮激酶(DHAK)

圖2Klebsiellapneumonia甘油代謝途徑

2.32 L發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將搖瓶實(shí)驗(yàn)中PDO產(chǎn)量最高的兩株菌k2、k7以及原始菌株進(jìn)行2L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖5所示。誘變后的兩株菌的生物量(OD600)比原始的菌株都要高，其中k7的OD值最高可達(dá)18.1，而原始菌株最高OD值是15.2，增加了19%。k2的OD值最高是16.2，相對(duì)原始菌株增加了6.5%。產(chǎn)物PDO如圖6所示，k7的產(chǎn)量是67.87 g/L，原始菌株P(guān)DO的最終產(chǎn)量是48.19 g/L，k7相對(duì)原始菌株增加了40.8%；k2的產(chǎn)量是69.71 g/L，增加了44.7%。

圖3　pH變化值

圖4　甘油消耗量

圖5　k2、k7與原始菌株生物量的比較

圖6　k2、k7與原始菌株P(guān)DO含量的比較

原始菌株與誘變菌株的最終發(fā)酵參數(shù)如表2所示，可以看出，k2的生物量不如k7的高，但是PDO的產(chǎn)量卻高于k7，k2的生物量比k7低了10.5%，但PDO的產(chǎn)量卻高了2.7%，這說明k2產(chǎn)PDO的能力強(qiáng)于k7。

如表2所示，原始菌株乙酸的最終產(chǎn)量是4.53g/L，相對(duì)PDO的含量是9.4%。誘變后k2、k7乙酸的產(chǎn)量分別是8.66 g/L、7.51 g/L，相對(duì)PDO的含量是12.42%、11%，由此看到誘變后菌株乙酸的產(chǎn)率增加，且k2高于k7。由圖7可以看到，菌株在發(fā)酵的過程中，副產(chǎn)物乙酸的合成主要是菌株對(duì)數(shù)生長期合成積累。在發(fā)酵初期以對(duì)數(shù)形式增長，到發(fā)酵中期12 h左右會(huì)達(dá)到峰值，繼續(xù)發(fā)酵產(chǎn)量會(huì)有所下降，增長趨勢與PDO一致。

表2　批式發(fā)酵結(jié)果

原始菌株乳酸的最終產(chǎn)量是22.14 g/L，相對(duì)PDO的含量是45.9%，誘變后k2、k7乳酸的產(chǎn)量分別21.53 g/L、27.3 g/L，相對(duì)PDO的含量是30.9%、40.2%，k2低于k7。圖8顯示，副產(chǎn)物乳酸是在發(fā)酵后期增加積累，在發(fā)酵的前12 h增長比較緩慢，到12 h以后開始大量合成，到24 h后進(jìn)入緩慢期。乳酸的合成不利于PDO的合成。有相關(guān)研究表明，敲除編碼乳酸脫氫酶的基因片段ldhA不會(huì)影響菌體生長代謝，菌濃度未有變化[10]。

圖7　副產(chǎn)物乙酸發(fā)酵結(jié)果

k2、k7菌株副產(chǎn)物2,3-丁二醇(2,3-BD)的產(chǎn)量明顯高于原始菌株(圖9)，且起始合成時(shí)間也提前了，原始菌株在發(fā)酵16h開始合成，而k2、k7在發(fā)酵10h開始合成且k7高于k2。生成2,3-BD雖需還原當(dāng)量，但其生成量對(duì)PDO的產(chǎn)量影響不大，并且2,3-BD是一種重要的化工原料和液體燃料，在化工、食品、燃料及航空航天等領(lǐng)域有很廣泛的應(yīng)用[11]。因此2,3-BD產(chǎn)量的增加對(duì)工廠的實(shí)際效益是有益的。有研究表明敲除乳酸支路還會(huì)有利于2,3-BD的生成量[12]。

圖8　乳酸發(fā)酵產(chǎn)量

圖9　2,3-丁二醇的發(fā)酵產(chǎn)量

K.pneumonia在誘變后可能會(huì)出現(xiàn)退化現(xiàn)象，不能穩(wěn)定遺傳誘變后的優(yōu)良性能。解決這一問題可以從下面兩個(gè)方面解決。一是用含高濃度PDO的培養(yǎng)基進(jìn)行多次培養(yǎng)。PDO雖對(duì)菌株有抑制作用，但該菌種產(chǎn)PDO的能力與其對(duì)PDO的耐受力成正相關(guān)。用高濃度PDO的選擇培養(yǎng)基來進(jìn)行多次培養(yǎng)馴化，可以使菌株對(duì)這種特殊環(huán)境的適應(yīng)性更強(qiáng)；另外馴化的過程又起到進(jìn)一步篩選的作用。二是選擇良好的保菌方式非常重要。本實(shí)驗(yàn)采用低溫冷凍法保藏菌種，將菌株放入一定比例的甘油管中，放入-80 ℃的超低溫冰箱中進(jìn)行保藏。

副產(chǎn)物乙酸、乳酸的產(chǎn)量與PDO的產(chǎn)量之間的關(guān)聯(lián)十分明顯，乙酸與PDO成正相關(guān)，乳酸與PDO成負(fù)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)沒有詳細(xì)考察副產(chǎn)物乙醇與PDO的關(guān)系，有文獻(xiàn)記載乙醇與PDO也是成負(fù)相關(guān)的。這些副產(chǎn)物對(duì)PDO的生成有很大的影響，是評(píng)定一株菌種是否優(yōu)良的重要參數(shù)[13-16]。后續(xù)實(shí)驗(yàn)計(jì)劃考察乙醇、琥珀酸等副產(chǎn)物以及產(chǎn)PDO的關(guān)鍵酶活與1,3-丙二醇產(chǎn)量的關(guān)系，從代謝途徑、代謝流節(jié)點(diǎn)代謝通量和副產(chǎn)物產(chǎn)量綜合分析菌種的各項(xiàng)性能，以求挑選出更優(yōu)更適合生產(chǎn)的菌種。

3結(jié)論

采用紫外復(fù)合等離子體誘變技術(shù)對(duì)K.pneumonia進(jìn)行誘變，用PDO濃度為90 g/L～100 g/L的選擇培養(yǎng)基對(duì)誘變后的菌株進(jìn)行培養(yǎng)篩選。通過發(fā)酵產(chǎn)物，如乙酸、乳酸、2,3-BD等產(chǎn)量與PDO產(chǎn)量之間的關(guān)系，以及菌株生物量和甘油消耗量的研究確定優(yōu)良菌株。最終獲得一株優(yōu)良菌株k2。2 L批式流加發(fā)酵結(jié)果表明：該菌株P(guān)DO產(chǎn)量為69.71 g/L，摩爾產(chǎn)率為0.57 mol/mol，生產(chǎn)強(qiáng)度為0.8 g/L·h，較原始菌株分別提高了44.7% 、21%和11.3%；副產(chǎn)物乙酸含量為8.66 g/L，較原始菌株提高了91.16%；乳酸產(chǎn)量為21.53 g/L，較原始菌株降低2.76%；2,3-BD含量為14.83 g/L，較原始菌株提高了151.3%。

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New combined mutagenesis for screening of high-yielding 1,3-propanediol strains

YU Yun-juan， LI Zhao-kun， LIU Yan， XU Dan-dan， WANG Feng-huan

Beijing Technology and Business University, Beijing 100048

AbstractIn order to improve the 1,3-propanediol production of Klebsiella pneumoniae, the multi-function plasma mutation and ultraviolet system(MPMS-UV)were performed for strain mutagenesis using nitrogen as working gas. The strains were screened using the selection culture medium with 90～100 g /L of 1,3-propanediol. Ultimately, a mutant strain k2 with high 1,3-propanediol yield and glycerol utilization was obtained. In 2 L fed-batch fermentation, the strain K. pneumoniae k2 could produce 1,3-propanediol as high as 69.71 g/L with high conversion rate of 0.57, which were 44.7% and 21% higher than those of the parent strain, respectively.

Key words1,3-propanediol; MPMS-UV combined mutagenesis; fermentation

基金項(xiàng)目：北京市青年英才計(jì)劃(YETP1450)。

作者簡介：于云娟(1990～)，女，碩士。 E-mail：yyjuan1050@foxmail.com。 *通訊作者：王鳳寰(1978～)，男，博士，副教授。E-mail：wangfenghuan@th.btbu.edu.cn。