李培玨，　侯晨曄，　李　勇，　孫　冰

1. 上海微創(chuàng)醫(yī)療器械(集團(tuán))有限公司， 上海 201203；2. 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 上海 200433

熒光快檢法用于工藝用水微生物檢測(cè)的研究

李培玨1,2，侯晨曄1*，李勇1，孫冰1

1. 上海微創(chuàng)醫(yī)療器械(集團(tuán))有限公司， 上海 201203；2. 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 上海 200433

摘要：為考察熒光快檢法用于測(cè)定水中微生物的可行性，使用6種常見試驗(yàn)菌，比較用傳統(tǒng)膜過濾法和熒光快檢法對(duì)微生物計(jì)數(shù)的應(yīng)用。結(jié)果表明使用熒光快檢法的培養(yǎng)時(shí)間，金黃色葡萄球菌17 h，大腸埃希菌15 h，枯草芽孢桿菌16 h，白色念珠菌36 h，黑曲霉51 h，銅綠假單胞菌19 h，所有菌種回收率都大于70%，且通過分析顯著性水平表明這兩種方法無顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，熒光快檢法可用于水中微生物的檢測(cè)，可大大縮短培養(yǎng)周期，且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。

關(guān)鍵詞：工藝用水； 熒光染色； 微生物快檢； 膜過濾法

對(duì)于食品、制藥、醫(yī)療器械等行業(yè)，工藝用水在其整個(gè)生產(chǎn)過程中通常是一個(gè)重要的原輔料，其微生物的含量通常直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量。目前水中微生物計(jì)數(shù)方法通常采用膜過濾法[1]或者直接接種法[2]，這類傳統(tǒng)計(jì)數(shù)方法檢測(cè)結(jié)果可靠，且易于操作，但是由于需要培養(yǎng)微生物至其形成肉眼可見菌落后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)，因此微生物的培養(yǎng)時(shí)間短則2 d，長至14 d。使用傳統(tǒng)微生物計(jì)數(shù)方法由于其檢測(cè)時(shí)間過長，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果滯后，不利于及時(shí)了解水中微生物狀況，影響企業(yè)對(duì)微生物污染控制的時(shí)效性，會(huì)由于無法及時(shí)發(fā)現(xiàn)問題并采取糾正措施而增加產(chǎn)品的潛在微生物污染風(fēng)險(xiǎn)，甚至導(dǎo)致大量產(chǎn)品的報(bào)廢，造成企業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失[3]。因此選用一種準(zhǔn)確、靈敏、快速的微生物檢測(cè)方法是目前企業(yè)所需要解決的重要且迫切的問題。

隨著微生物學(xué)的迅速發(fā)展，不斷有新的微生物檢驗(yàn)技術(shù)被引入，來縮短微生物的培養(yǎng)時(shí)間[4-6]。本實(shí)驗(yàn)所選用的熒光快檢法結(jié)合了熒光染色法和薄膜過濾法，使用的設(shè)備為EZ-FLUO快速微生物檢測(cè)系統(tǒng)。該方法采用酶促反應(yīng)熒光染色技術(shù)，整個(gè)檢測(cè)過程不破壞微生物細(xì)胞。其標(biāo)記試劑在細(xì)胞外，本身是不發(fā)熒光的，但轉(zhuǎn)移進(jìn)入活的微生物體內(nèi)后，能被微生物的新陳代謝所利用，從而產(chǎn)生能被激發(fā)產(chǎn)生熒光的反應(yīng)產(chǎn)物，隨著產(chǎn)物的積累(產(chǎn)物本身不能被細(xì)胞主動(dòng)轉(zhuǎn)移出體外)，熒光的量達(dá)到能被讀數(shù)器所識(shí)別就能被準(zhǔn)確的計(jì)數(shù)。

本實(shí)驗(yàn)中通過對(duì)六種常見微生物的傳統(tǒng)膜過濾法和熒光快檢方法的實(shí)驗(yàn)對(duì)比，以確定熒光快檢法用于測(cè)定水中微生物的可行性。

1材料與方法

1.1設(shè)備

EZ-FLUOTM快速微生物檢測(cè)系統(tǒng)：Merck Millipore；

三聯(lián)過濾系統(tǒng)：Merck Millipore；

生物安全柜：SY-08-056，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；

生化培養(yǎng)箱：SPX-150BS-II，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；

霉菌培養(yǎng)箱：MJ-160BS-II，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；

立式蒸汽壓力滅菌器：CL-32L，ALP。

1.2菌種

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) (CMCC(B)26003)；大腸埃希菌(EscherichiaColi) (CMCC(B) 44102)；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) (CMCC(B)63501)；白色念珠菌(Candidaalbicans) (CMCC(F)98001)；黑曲霉(Aspergillusniger) (CMCC(F)98003)；銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) (CMCC(B)10104)。

以上菌種均為BioBall定量菌株：生物梅里埃公司。

1.3試劑及培養(yǎng)基

熒光染色液：Merck Millipore；

氯化鈉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；

玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.4方法

1.4.1試驗(yàn)組設(shè)計(jì)

每次試驗(yàn)需進(jìn)行以下三個(gè)試驗(yàn)組的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

F組：熒光快檢組，按縮短的培養(yǎng)時(shí)間，進(jìn)行熒光讀數(shù)，所計(jì)得的菌落數(shù)；

V組：恢復(fù)生長組，熒光快檢組的濾膜，經(jīng)過熒光讀數(shù)后，轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至傳統(tǒng)方法的時(shí)間點(diǎn)，進(jìn)行肉眼觀察，所計(jì)得的菌落數(shù)；

T組：傳統(tǒng)對(duì)照組，按傳統(tǒng)方法的時(shí)間培養(yǎng)，進(jìn)行肉眼觀察，所計(jì)得的菌落數(shù)；

陰性對(duì)照組：取稀釋菌液所用生理鹽水1 mL和沖洗用0.1%蛋白胨水溶液200 mL，過濾，每完成一組F組，V組或T組，均需附加一份陰性對(duì)照平皿。

表1　快檢時(shí)間耐用性試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)菌株的F組，V組和T組的培養(yǎng)時(shí)間

取各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株的培養(yǎng)物，制備成約0～100 cfu/mL濃度范圍的菌液。進(jìn)行微生物過濾，培養(yǎng)和計(jì)數(shù)，每種菌株均選取三個(gè)不同快檢時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行熒光染色計(jì)數(shù)。對(duì)于每個(gè)時(shí)間條件， F、V和T各組均測(cè)試5份平行的平板。

1.4.2熒光快檢法操作步驟

-將實(shí)驗(yàn)菌液過濾至濾膜上

-將濾膜轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至特定時(shí)間(F組培養(yǎng)時(shí)間)

-將濾膜再次轉(zhuǎn)移至含有染色劑的培養(yǎng)皿上

-培養(yǎng)30 min，染色劑底物被酶切

-通過讀數(shù)器讀取熒光數(shù)量(即為F組讀數(shù))

-將濾膜重新轉(zhuǎn)移至新鮮固體培養(yǎng)基上重新培養(yǎng)至特定時(shí)間(V組培養(yǎng)時(shí)間)后，菌落計(jì)數(shù)(即為V組讀數(shù))

1.4.3傳統(tǒng)膜過濾法操作步驟

-將實(shí)驗(yàn)菌液過濾至濾膜上

-將濾膜轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至特定時(shí)間(T組培養(yǎng)時(shí)間)

-菌落計(jì)數(shù)(即為T組讀數(shù))

1.4.4數(shù)據(jù)處理

1.4.4.1回收率考察

熒光快檢組(F組)的單塊平板回收率計(jì)算如下：

F組單塊平板回收率=F組每塊平板菌落數(shù)/T組平均菌落數(shù)×100%

以此得出1組共5份F單塊平板回收率；三個(gè)快檢時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)獲得三組的F單塊平板回收率結(jié)果。

恢復(fù)生長組(V組)數(shù)據(jù)同法處理：

V組單塊平板回收率=V組單塊平板菌落數(shù)/T組平均菌落數(shù)×100%

回收率不得低于70%。

1.4.4.2方差分析

在三個(gè)不同快檢時(shí)間試驗(yàn)條件下，對(duì)各試驗(yàn)菌的F組或V組單塊平板回收率進(jìn)行比較，三組數(shù)據(jù)之間進(jìn)行方差分析的多重比較(即Tukey法)，確定其差異性。

2結(jié)果與討論

2.1熒光快檢法的熒光強(qiáng)度

在三個(gè)不同培養(yǎng)條件下，所有F組的平板均能表現(xiàn)出較好的發(fā)光強(qiáng)度。

6種微生物在設(shè)定的F組中間培養(yǎng)時(shí)間條件下，即：金黃色葡萄球菌培養(yǎng)17 h、大腸埃希菌培養(yǎng)15 h、枯草芽孢桿菌培養(yǎng)16 h、白色念珠菌培養(yǎng)36 h、銅綠假單胞菌培養(yǎng)19 h、黑曲霉培養(yǎng)51 h，F(xiàn)組的熒光圖見圖1和圖2。

從圖中可看出：

① 金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌經(jīng)過設(shè)定的F組中間培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)后，通過EZ-FLUO讀數(shù)器能看出清晰可辨的亮點(diǎn)，通過計(jì)亮點(diǎn)的數(shù)量可容易地進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

② 銅綠假單胞菌經(jīng)過19 h培養(yǎng)后，通過EZ-FLUO讀數(shù)器看出的亮點(diǎn)大卻不夠清晰，發(fā)光強(qiáng)度不均勻。但從圖中可看出，若增加培養(yǎng)時(shí)間，菌落變大則發(fā)光強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)，從而導(dǎo)致熒光點(diǎn)相互重疊，并不利于進(jìn)行熒光點(diǎn)計(jì)數(shù)。因此認(rèn)為19 h是較為合理的銅綠假單胞菌培養(yǎng)時(shí)間。

③ 黑曲霉經(jīng)過51 h培養(yǎng)后，可以看出菌絲也出現(xiàn)了熒光，盡管發(fā)光強(qiáng)度比除銅綠假單胞菌外的其余4種微生物稍差，但是仍可通過EZ-FLUO讀數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)?？紤]到增加培養(yǎng)時(shí)間可能出現(xiàn)菌絲過多而相互交集導(dǎo)致最終計(jì)數(shù)困難，因此認(rèn)為51 h是較為合理的黑曲霉培養(yǎng)時(shí)間。

金黃色葡萄球菌培養(yǎng)17 h

大腸埃希菌培養(yǎng)15 h

枯草芽孢桿菌培養(yǎng)16 h

白色念珠菌培養(yǎng)36 h

銅綠假單胞菌培養(yǎng)19 h

圖2銅綠假單胞菌、黑曲霉熒光圖

2.2回收率和方差分析

6種微生物的所有F組或V組的單塊平板回收率均大于70%。各組的單塊平板回收率經(jīng)正態(tài)分布檢驗(yàn)，均服從正態(tài)分布；在三個(gè)不同快檢時(shí)間試驗(yàn)條件下，各試驗(yàn)菌的F組或V組單塊平板回收率進(jìn)行比較，三組數(shù)據(jù)之間進(jìn)行方差分析的多重比較，即Tukey法，經(jīng)計(jì)算任意兩總體均值差的置信區(qū)間，此區(qū)間均包含0，故任意兩總體均值無顯著差異。

各菌種回收率的結(jié)果見表2～7：

表2　金黃色葡萄球菌回收率

表3　大腸埃希菌回收率

表4　枯草芽孢桿菌回收率

表5　白色念珠菌回收率

表6　黑曲霉回收率

表7　銅綠假單胞菌回收率

3結(jié)論

通過對(duì)6種常見試驗(yàn)菌株的熒光快檢法與傳統(tǒng)膜過濾法的檢測(cè)對(duì)比，可以看出在設(shè)定的培養(yǎng)時(shí)間條件下，回收率均大于70%，且沒有顯著性差異。

從熒光計(jì)數(shù)效果來看，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的發(fā)光強(qiáng)度易被計(jì)數(shù)。銅綠假單胞菌經(jīng)過19 h培養(yǎng)后，發(fā)光效果略差于以上4種微生物，但如繼續(xù)培養(yǎng)，則發(fā)光強(qiáng)度增加的同時(shí)菌落也將逐漸變大，菌落過度交集反而不利于熒光計(jì)數(shù)，因此認(rèn)為19 h是較為合理的銅綠假單胞菌的培養(yǎng)時(shí)間。黑曲霉經(jīng)過51 h培養(yǎng)后，可以看出菌絲也出現(xiàn)了熒光，盡管發(fā)光強(qiáng)度較弱，但仍可計(jì)數(shù)，若增加培養(yǎng)時(shí)間可能出現(xiàn)菌絲過多而相互交集導(dǎo)致最終計(jì)數(shù)困難，因此認(rèn)為51 h是較為合理的黑曲霉培養(yǎng)時(shí)間。

因此，使用熒光快檢法，金黃色葡萄球菌培養(yǎng)17 h，大腸埃希菌培養(yǎng)15 h，枯草芽孢桿菌培養(yǎng)16 h，白色念珠菌培養(yǎng)36 h，黑曲霉培養(yǎng)51 h，銅綠假單胞菌培養(yǎng)19 h，可滿足檢測(cè)要求。

近年，微生物快速檢測(cè)法越來越多地應(yīng)用于食品、制藥、醫(yī)療器械等行業(yè)中[7-10]。將該快檢法應(yīng)用與工藝用水的微生物計(jì)數(shù)中，可大大縮短傳統(tǒng)的培養(yǎng)周期，很好的解決了微生物測(cè)試結(jié)果的滯后性，能快速發(fā)現(xiàn)結(jié)果是否有異常，降低了生產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。

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Detection of microbiological contaminants in process water by fluorescence-based rapid detection method

LI Pei-jue1,2， HOU Chen-ye1， LI Yong1， SUN Bing1

1. Shanghai Microprot Medical(Group)Co.Ltd, Shanghai 201203, China；2. School of Life Sciences Fudan University. Shanghai 200433, China

AbstractThe application of fluorescent-based rapid detection method for microbiological contaminants in water was investigated, and then compared with the the membrane filtration method with six different test strains. The results showed that the culturing time by fluorescent rapid detection method were as follows: Staphylococcus aureus 17 h, Escherichia coli 15 h, Bacillus subtilis 16 h, Candida albicans 36 h, Aspergillus niger 51 h, Pseudomonas aeruginosa 19 h; recoveries of all the strains were more than 70%. The significance level indicated that there was no significant difference between two methods. The results showed that the fluorescence-based rapid detection method could be used in the microbial tests for water with advantages of greatly shortened culture period and accurate test result.

Key wordsprocess water; fluorescence staining; rapid detection of microorganism; membrane filtration method

作者簡(jiǎn)介：李培玨(1983～)，女，碩士在讀，工程師。E-mail：pelldgei@163.com。 *通訊作者: 侯晨曄(1986～)，女，碩士，工程師。電話：021-38954600-3291，E-mail：cyhou@microport.com。