劉娟

治療性HBV DNA疫苗的研究及進(jìn)展

劉娟

HBV DNA疫苗是通過(guò)向體內(nèi)遞送編碼HBV抗原的外源性重組質(zhì)粒，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)，由于其能較好的誘發(fā)Th1型細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒反應(yīng)，而且同蛋白質(zhì)疫苗相比設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單，生產(chǎn)高純度產(chǎn)品所需成本更低，因此DNA疫苗成為對(duì)慢性乙肝進(jìn)行免疫治療的一種選擇，它不僅可作為預(yù)防性疫苗，也可作為治療性疫苗，在乙型肝炎預(yù)防和治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。

慢性乙型病毒性肝炎；DNA疫苗；免疫反應(yīng)

全世界約有2.4億例慢性乙型肝炎（簡(jiǎn)稱乙肝）病毒（HBV）慢性攜帶者[1]。我國(guó)屬于HBV感染的高流行區(qū)，乙肝表面抗原檢出率約10%，其中慢性乙型肝炎患者約3千萬(wàn)人。對(duì)此類患者目前公認(rèn)有效的藥物包括干擾素和核苷酸類似物，但前者有效率僅為10%～30%且不良反應(yīng)大，后者療效短暫并易產(chǎn)生耐藥，故常導(dǎo)致患者病情遷延不愈，每年有65萬(wàn)患者死于肝衰竭、肝硬化、肝癌[2]。盡管利用計(jì)劃免疫控制乙肝已成為世界各國(guó)的共識(shí)，然而在接種乙肝疫苗的健康人群中約有5%～10%的人表現(xiàn)為對(duì)疫苗抗原的無(wú)應(yīng)答或弱應(yīng)答[3]，不能產(chǎn)生保護(hù)力水平的抗體。因此，研制新的疫苗或藥物去抑制和消除HBV，降低肝臟失代償、肝硬化和肝癌發(fā)病率成為目前急需解決的問(wèn)題。1993年，Mancini等[4]報(bào)道HBV DNA疫苗免疫的HBV Tg小鼠血清HBsAg滴度明顯下降或完全清除，發(fā)現(xiàn)乙肝DNA疫苗在誘導(dǎo)機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)后，HBV-DNA疫苗就作為一種針對(duì)慢性乙肝的具有潛力的免疫治療手段被廣泛研究。

1 HBV DNA疫苗的作用機(jī)制及治療依據(jù)

HBV DNA疫苗接種機(jī)體后目的基因的表達(dá)產(chǎn)物系內(nèi)源性抗原，激發(fā)體液、細(xì)胞免疫機(jī)制而達(dá)到防治乙型肝炎的目的。

DNA疫苗（質(zhì)粒）在注射部位被細(xì)胞攝取后通過(guò)轉(zhuǎn)錄翻譯生成蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)通過(guò)胞內(nèi)處理后．把信息遞呈給I類MHC限制性CD8+T細(xì)胞，表達(dá)I類MHC分子或共刺激分子。攝取質(zhì)粒的細(xì)胞能分泌釋放抗原，刺激B細(xì)胞生成抗體。同時(shí)抗原被

APC細(xì)胞（抗原遞呈細(xì)胞）攝取，通過(guò)Ⅱ類MHC分子，遞呈給

CD4+T細(xì)胞和B細(xì)胞，識(shí)別病毒感染的細(xì)胞。在此過(guò)程CTL（細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞）介導(dǎo)細(xì)胞免疫對(duì)病毒感染預(yù)防起著重要的作用[4]。CTL能識(shí)別細(xì)胞表面的病毒蛋白，通過(guò)感染細(xì)胞的細(xì)胞溶解機(jī)制和通過(guò)細(xì)胞因子非細(xì)胞溶解機(jī)制來(lái)完成。CTL能針對(duì)病毒抗原決定簇產(chǎn)生交叉反應(yīng)，故能針對(duì)不同細(xì)胞株而產(chǎn)生較強(qiáng)保護(hù)作用[5]。研究證實(shí)，發(fā)生乙肝慢性化的主要原因是慢性患者CTL反應(yīng)低下，而治療慢性乙肝的根本在于提高針對(duì)

HBV的特異性細(xì)胞免疫水平，激活特異性CTL，并使其長(zhǎng)期維持，清除慢性感染患者體內(nèi)的HBV[6]，打破對(duì)HBV的免疫耐受。Webster等[7]發(fā)現(xiàn)在不損傷肝細(xì)胞的情況下，CTL通過(guò)細(xì)胞接觸和釋放細(xì)胞因子激活細(xì)胞自身抗病毒機(jī)制也可達(dá)到清除HBV DNA核殼蛋白和DNA復(fù)制中間體的目的，這一發(fā)現(xiàn)為治療性HBV DNA疫苗的應(yīng)用進(jìn)一步提供了依據(jù)。

2 抗原編碼基因的選擇

HBsAg含有誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生HBV中和抗體的抗原決定簇，可以很快誘導(dǎo)出體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，是首選目的基因。前S2抗原中存在T細(xì)胞激活表位，免疫原性強(qiáng)，與S抗原聯(lián)用能夠提高機(jī)體對(duì)HBsAg的抗體應(yīng)答水平，克服亞單位疫苗無(wú)應(yīng)答現(xiàn)象。

HbcAg/HBeAg基因是HBV DNA疫苗的另一重要基因。HBcAg是具有高度免疫原性的人類T細(xì)胞抗原，可以誘導(dǎo)出MHC I類限制性CTL反應(yīng)。胞內(nèi)HbeAg前體與HBcAg有70%的共同序列，可以通過(guò)MHC I類、Ⅱ類抗原路徑被CD4+T細(xì)胞識(shí)別，胞內(nèi)共表達(dá)HBeAg會(huì)使受染肝細(xì)胞更易被HBeAg/ HBcAg特異性T細(xì)胞發(fā)現(xiàn)[8]。

3 DNA疫苗的導(dǎo)入

DNA疫苗在小型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)有較強(qiáng)的誘發(fā)免疫反應(yīng)的潛力，但在大多數(shù)大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中免疫反應(yīng)較為緩和并且短暫，這可能與轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒基因表達(dá)水平較低有關(guān)。關(guān)于DNA疫苗體內(nèi)導(dǎo)入的研究發(fā)展很快，從最初的直接肌肉注射到基因槍接種，再發(fā)展到近幾年出現(xiàn)的電穿孔技術(shù)，質(zhì)粒DNA的體內(nèi)遞送效率顯著提高，其中電穿孔導(dǎo)入技術(shù)利用電離使細(xì)胞膜上出現(xiàn)短時(shí)的多個(gè)孔道以增加質(zhì)粒的導(dǎo)入量，而且還造成了細(xì)胞因子的表達(dá)上調(diào)和炎細(xì)胞浸潤(rùn)，從而促進(jìn)免疫系統(tǒng)的激活，它因兼?zhèn)涓咝А踩?、操作?jiǎn)便和低成本等多項(xiàng)特質(zhì)[9-10]，成為DNA疫苗導(dǎo)入的首選方案。

4 DNA疫苗的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1996年Mancini等發(fā)現(xiàn)，單次HBsAg DNA免疫HBV轉(zhuǎn)基因（Tg）小鼠，其外周血中HBsAg顆粒完全消失并持續(xù)5個(gè)月以上，肝組織中HBV mRNA的表達(dá)下降，脾細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移試驗(yàn)證實(shí)這一作用是由CD4+Th1細(xì)胞和CD8+CTL共同介導(dǎo)的，表明DNA疫苗誘導(dǎo)的CTL免疫應(yīng)答對(duì)清除體內(nèi)持續(xù)性病毒感染有療效[11]。

Kuhober等用編碼HbcAg和HBeAg基因的DNA疫苗免疫小鼠，均可有效誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體應(yīng)答和CTL應(yīng)答，且反應(yīng)強(qiáng)度相當(dāng)。Huang ZH[12]用HBcAg DNA疫苗免疫獼猴，結(jié)果產(chǎn)生高滴度抗HBc IgG亞類以IgG2占優(yōu)勢(shì)，免疫反應(yīng)偏向于Th1型。

基因佐劑的應(yīng)用可從更深層次上提高機(jī)體對(duì)HBV DNA疫苗的免疫應(yīng)答。IL-2[13]、IL-12[14]、IL-22[15]等TH1型細(xì)胞因子的基因聯(lián)合DNA疫苗免疫能影響Th1細(xì)胞的分化，以及免疫反應(yīng)的類型，可更好地增強(qiáng)免疫效果，起到良好的佐劑作用。

5 DNA疫苗的臨床研究

1999年Tacket等[16]對(duì)7名健康志愿者進(jìn)行了HBsAg DNA疫苗的安全性及耐受性測(cè)試，使用PowderJectXR1裝置將HBsAgDNA疫苗接種到受試者皮下，所有志愿者耐受性良好，未報(bào)導(dǎo)明顯不良反應(yīng)，其中6名產(chǎn)生了持久的HBsAb，1名未產(chǎn)生抗體者經(jīng)回顧調(diào)查認(rèn)為既往曾接觸過(guò)HBV。本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小劑量（0.25 mg）不能誘導(dǎo)體液免疫，8周以后經(jīng)過(guò)加強(qiáng)方誘導(dǎo)出HbsAb。由此可見(jiàn)HBV DNA疫苗可作為健康人乙肝的預(yù)防性疫苗。

2003年Rottinghaus等[17]使用PMED系統(tǒng)（particle 2 mediated epidermal delivery）對(duì)16位常規(guī)乙肝疫苗接種后無(wú)反應(yīng)的健康志愿者進(jìn)行HBV DNA疫苗接種（這16位志愿者接受過(guò)正規(guī)的3次亞單位疫苗接種），其中12位產(chǎn)生了持久的保護(hù)性抗體反應(yīng)，進(jìn)一步顯示出HBVDNA疫苗在疫苗接種后無(wú)反應(yīng)或低反應(yīng)者中的優(yōu)勢(shì)。

2004年法國(guó)巴斯德研究所的Mancini-Bourgine等[18]應(yīng)用編碼preS2/S蛋白的重組質(zhì)粒免疫10例慢性乙肝病毒攜帶者。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，疫苗能夠被慢性乙肝病毒攜帶者很好地耐受。有2例攜帶者的PBMC發(fā)生抗原特異性的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，并且抗HBV特異性分泌IFN-γ的T細(xì)胞數(shù)目在免疫后有較大幅度的提高。有5例攜帶者的血清HBV DNA水平下降，但是這種下降僅僅是暫時(shí)性的。研究者隨后設(shè)計(jì)了臨床Ⅰ期試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)表達(dá)HBsAg和preS2/S的DNA疫苗的安全性、耐受性和免疫原性。10例HBeAg陽(yáng)性的慢性乙肝患者接受了DNA疫苗的治療后耐受性較好，經(jīng)3次疫苗注射后，全部患者產(chǎn)生了特異性抗HBsAg的分泌IFN-γ型T細(xì)胞，50%患者產(chǎn)生了抗preS2抗原的T細(xì)胞。研究證明了治療性DNA疫苗的安全性和免疫效率，并且說(shuō)明DNA疫苗接種能在部分慢性HBV攜帶者體內(nèi)誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞反應(yīng)，顯示出HBV DNA疫苗作為治療慢性乙型肝炎的有效工具的潛力。

對(duì)慢性乙肝患者而言，一個(gè)合理的治療策略可以包括抗病毒藥物對(duì)病毒復(fù)制的直接抑制作用以幫助恢復(fù)T細(xì)胞的反應(yīng)性，以及疫苗強(qiáng)有力的外源性刺激來(lái)引發(fā)B細(xì)胞和T細(xì)胞反應(yīng)。而將治療性疫苗同其他抗病毒藥聯(lián)合使用較好的體現(xiàn)了這一策略，同時(shí)這一策略也在一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)中得到了證實(shí)。如在鴨感染鴨乙型肝炎病毒的早期階段進(jìn)行核酸類似物恩替卡韋（ETV）的治療，可阻止DHBV的擴(kuò)散并導(dǎo)致50%的鴨的病毒肝細(xì)胞徹底清除，Miller等[19]聯(lián)合使用ETV和表達(dá)PreS/S抗原的DNA疫苗對(duì)感染的鴨進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)感染后67天時(shí)，全部感染的鴨都清除了病毒，停藥后也無(wú)復(fù)發(fā)；而對(duì)照組采用ETV和空白DNA載體治療，結(jié)果仍有60%病例在ETV停用后感染擴(kuò)散。Yang SH等[20]將4種HBV的質(zhì)粒（pGX10S+pGX10S1/ S2/X+pGX10core+pGX10Po1）混合與pGX10hIL-12N222L為佐劑一起免疫，每月1次，并口服拉米夫定100 mg/d，聯(lián)合治療12例CHB患者，治療結(jié)束隨訪12個(gè)月后50%HBV DNA轉(zhuǎn)陰，而且耐受性良好。同時(shí)進(jìn)行的ELISPOT檢測(cè)表明Thl細(xì)胞反應(yīng)，尤其是CD4+記憶T細(xì)胞反應(yīng)至少可以維持40周。

我國(guó)食品藥品監(jiān)督局首個(gè)批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床研究的治療性

DNA疫苗為雙質(zhì)粒乙肝DNA疫苗，它是以編碼HBV抗原蛋白preS2+S的真核表達(dá)質(zhì)粒pS2.S作為疫苗，人IL-2和

IFNγ融合蛋白的質(zhì)粒作為佐劑，通過(guò)在體電脈沖技術(shù)肌內(nèi)注射給藥。在Ⅰ期試驗(yàn)中，30名健康志愿者都未出現(xiàn)不良反應(yīng)，證明該疫苗有較好的安全性和耐受性[21]。Ⅱa期試驗(yàn)是據(jù)轉(zhuǎn)氨酶水平將CHB患者分為2組：n1組為轉(zhuǎn)氨酶水平比正常水平高1～2倍，只接受DNA疫苗治療（n1=6）；n2組為轉(zhuǎn)氨酶水平高于正常水平2倍以上（n2=33），隨機(jī)按1∶2比例接受LAM+安慰劑（對(duì)照組）或LAM+DNA疫苗（治療組）治療。結(jié)果表明：n1組即低轉(zhuǎn)氨酶患者組產(chǎn)生特異性分泌IFNγ的T淋巴細(xì)胞，DNA疫苗能夠有效誘導(dǎo)抗HBV特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。另一組中接受

LAM+DNA疫苗的患者在36周時(shí)可測(cè)得HBV DNA抑制率比LAM+安慰劑患者高，在第60周時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（90.9% vs 54.5%，P=0.030）；且HBV基因耐藥雙位點(diǎn)變異（rtM204V/ I/S+rtL180 M）發(fā)生例數(shù)較后者少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（4.5% vs 36.4%，P=0.030）；與LAM+安慰劑對(duì)照組比較，LAM+DNA疫苗治療組顯示較低的病毒學(xué)突破率（P=0.030）和更高的HBV特異性T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答率[22]。為進(jìn)一步證明LAM+DNA疫苗治療組的有效性和安全性，研究者將樣本例數(shù)擴(kuò)大至225例進(jìn)行Ⅱb臨床多中心隨機(jī)雙盲試驗(yàn)，目前數(shù)據(jù)顯示：同前一樣，在血清HBV DNA抑制率和HBeAg轉(zhuǎn)換率中治療組優(yōu)于對(duì)照組。HBV DNA抑制率在48周時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（10.3% vs 3.5%，P=0.044）。在第72周時(shí)，治療組具有較高的HBeAg轉(zhuǎn)換率（54.5% vs 15.8%，P=0.040），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示雙質(zhì)粒

HBV DNA疫苗可誘導(dǎo)較強(qiáng)的病毒特異性T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答。

韓國(guó)浦項(xiàng)（Pohang）科技大學(xué)開(kāi)發(fā)HB100 DNA疫苗，包括了5個(gè)表達(dá)所有HBV抗原蛋白和IL212的pGX10質(zhì)粒[pGX10S（2 mg）+pGX10S1/S2/X（1.5 mg）+pGX10core（1.5mg）+pGX10Pol（1 mg）+pGX10h IL212N222L（2 mg）]，研究者制定12例慢乙肝患者先接受拉米夫定治療8周，再予HB-100疫苗治療的方法，目的為觀察疫苗和拉米夫定連用是否抗原特異免疫反應(yīng)，拉米夫定停藥后T細(xì)胞反應(yīng)是否抑制病毒反彈，為臨床I期，結(jié)果表明DNA疫苗和拉米夫定聯(lián)用患者耐受性好，有50%的患者病毒滴度降低，伴隨產(chǎn)生HBV特異性分泌

IFN2γ的T細(xì)胞，CD4+記憶性T細(xì)胞在治療結(jié)束40周后仍檢測(cè)到，但該臨床試驗(yàn)沒(méi)有設(shè)對(duì)照[23]。

比利時(shí)Innogenetics公司利用Epim2mune公司的多表位技術(shù)開(kāi)發(fā)HBV多表位DNA疫苗，已經(jīng)在美國(guó)完成I期臨床。疫苗包含一個(gè)編碼30個(gè)HBV CTL表位和16個(gè)Th表位的

DNA載體，這些表位預(yù)期能被95%的HLA人群的T細(xì)胞識(shí)別。研究目的是DNA多表位疫苗的安全性和耐受性研究，肌內(nèi)注射0.4 mg或4 mg劑量疫苗，12周內(nèi)每4周注射1次，共4次，在所有健康的受試者中安全且耐受性好[24]。

從上看出，目前乙肝DNA疫苗的研制主要圍繞多表位、多載體，增加免疫佐劑等方面，而2015年韓國(guó)研究者做了一項(xiàng)新的嘗試，將HB-100改進(jìn)為HB-110，并將改進(jìn)后的HB-110導(dǎo)入韓國(guó)患者，同時(shí)將HB-100導(dǎo)入白人患者，結(jié)果表明前者比后者表現(xiàn)出更弱的誘導(dǎo)HBV特異性T細(xì)胞應(yīng)答和血清轉(zhuǎn)換的能力[25]。作為亞洲患者，一般通過(guò)母嬰垂直傳播感染的患者，似乎比白人有更高的免疫耐受水平，所以要開(kāi)發(fā)有效的治療HBV DNA疫苗的新方法，比起增強(qiáng)免疫原性，打破免疫耐受可能更迫切需要。

6 結(jié)語(yǔ)

慢性乙型肝炎是危害人民身體健康的重大傳染病，目前使用的藥物僅能抑制病毒復(fù)制，不能徹底清除病毒。免疫治療成為慢乙肝治療的一個(gè)重要手段，而如何有效、全面地激發(fā)患者的免疫系統(tǒng)，重建對(duì)乙型肝炎病毒的免疫力，可能是消除慢性感染的關(guān)鍵。乙肝DNA疫苗，無(wú)論是編碼表面抗原還是編碼核心抗原，均可誘導(dǎo)出HBV特異性的CTL反應(yīng)。

DNA疫苗的免疫保護(hù)作用已得到公認(rèn)，與核苷類似物的聯(lián)用在臨床試驗(yàn)上也被證實(shí)能提高HBV-DNA陰轉(zhuǎn)，HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率，在部分慢乙肝患者體內(nèi)誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)，使治療性HBV-DNA疫苗有望成為新的治療策略。但HBV-DNA疫苗要在臨床上廣泛應(yīng)用，還有很長(zhǎng)的路要走。DNA疫苗還有很多環(huán)節(jié)需要深入的探討和研究如HBV DNA疫苗療程的選擇，增強(qiáng)免疫原及其接種的時(shí)機(jī)的選擇，與何種抗病毒藥物聯(lián)用、時(shí)機(jī)選擇、如何實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療等。由于DNA疫苗轉(zhuǎn)染率較低，免疫反應(yīng)起效慢，效果較弱，如何更好地提高HBV特異性免疫應(yīng)答的強(qiáng)度，并延長(zhǎng)其持續(xù)時(shí)間，均是治療性HBV-DNA疫苗研究和開(kāi)發(fā)過(guò)程中亟待解決的問(wèn)題。而DNA疫苗研究時(shí)間較短，已完成的臨床研究不多，而且其作用機(jī)制尚不十分清楚，但隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)等相關(guān)科學(xué)的發(fā)展，相信在不久的將來(lái)，治療性HBV DNA疫苗在經(jīng)過(guò)不斷改善提高后將為人類根治乙肝起到重要作用。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2016.32.006

江西 341000 贛州市人民醫(yī)院感染性疾病科（劉娟）