(豆興堂，李萬波，王家明，楊秋鳳)

(遼寧省畜牧科學研究院，遼寧 遼陽 111000)

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羊誘導多能性干細胞研究概況

(豆興堂，李萬波，王家明，楊秋鳳)

(遼寧省畜牧科學研究院，遼寧 遼陽 111000)

摘要：體細胞重編程是產(chǎn)生干細胞的重要途徑。體細胞內(nèi)導入特定的誘導因子，可將其重編程為誘導多潛能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，iPSCs同胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)一樣具有自我更新并維持未分化狀態(tài)的能力。利用小分子化合物組合進行體細胞重編程，使iPSCs技術(shù)向安全應用更近一步。羊方面已經(jīng)獲得了iPSCs，并生產(chǎn)出了iPSCs 嵌合羊。本文主要從體細胞重編程、iPSCs誘導方法、誘導因子和iPSCs鑒定研究現(xiàn)狀作一綜述。

關(guān)鍵詞：羊；體細胞重編程；誘導多能干細胞

誘導多能干細胞技術(shù)是近年來干細胞領(lǐng)域最令人矚目的一項新興干細胞制造技術(shù)。通過病毒載體或構(gòu)建的特異載體將特定轉(zhuǎn)錄因子組合轉(zhuǎn)入被誘導細胞中，從而誘導已分化的體細胞重編程為未分化的多能細胞，為干細胞應用技術(shù)研究開辟了一條新途徑。iPSCs與ESCs極為類似，具有多能性和自我更新的能力[1]。iPSCs具有同胚胎干細胞類似的特性并能在適當?shù)恼T導條件下分化為3個胚層的細胞，是具有全能分化能力的干細胞。體細胞重編程是實現(xiàn)體細胞向干細胞轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素。iPSCs重編程方法、誘導因子、鑒定方法等是iPSCs技術(shù)的重要研究內(nèi)容。

1體細胞重編程技術(shù)

在哺乳動物發(fā)育的過程中，是由具有全能性的受精卵開始，逐漸地經(jīng)歷2細胞、4細胞、8細胞、桑椹胚和囊胚等階段，最終分化為特定的組織器官形成一個完整個體。這是一個全能性到多能性再到最后的單能性的過程，細胞的可塑性就會逐漸失去，進而成為某一特定類型的細胞。然而，卻有一些試驗方法可以使不同類型細胞之間的轉(zhuǎn)換成為可能，這就是細胞重編程技術(shù)。體細胞重編程主要指的是分化的體細胞在特定的條件下被逆轉(zhuǎn)后恢復具有自我更新能力和分化潛能的胚胎干細胞狀態(tài)[2]。目前最常用的重編程方法包括：體細胞核移植、體細胞與胚胎干細胞進行融合、特定轉(zhuǎn)錄因子誘導技術(shù)等。

1.1體細胞核移植重編程為多能干細胞

體細胞核移植(Somatic Cell Nuclear Transfer，SCNT)技術(shù)是研究最早的細胞重編程技術(shù)。早在1952年Briggs與King[3]首次報道了林蛙成功核移植試驗，并且成功孵化出正常的蝌蚪。到2007年Egli[4]等以成年小鼠體細胞作為供核細胞，以受精卵作為受體，通過核移植技術(shù)獲得多能性細胞?？傊瑥膭游锟寺〗Y(jié)果看，細胞核重編程效率與供核細胞分化程度成反比，克隆囊胚分離ESCs克隆和正常胚胎克隆，克隆效率都非常低，通過SCNT技術(shù)獲得ESCs系在技術(shù)上還存在困難。

1.2體細胞與ESCs融合重編程為ESCs

細胞融合技術(shù)(cellular fusion)，將體細胞與胚胎癌細胞、胚胎生殖細胞、ESCs融合，可以發(fā)生重編程為多能干細胞。2001年Tada等[5]利用電融合技術(shù)，將體細胞與小鼠ESCs融合，得到多能性細胞。2005年Cowan等[6]報道了人類ESCs通過融合后得到多能性細胞的研究。由于融合細胞內(nèi)存在ESCs基因組，移植排斥反應不可避免，如何真正去除這些ESCs來源的基因組是目前還不容易克服的難題。

2006年Takahashi與Yamanaka等[7]使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體把24個與細胞多向分化潛能和保持多能分化狀態(tài)相關(guān)的候選基因逐一導入小鼠胚胎成纖維細胞中(mouse embryonic fibroblasts，MEF)，最終明確了 Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4這4種轉(zhuǎn)錄因子(OSKM)導入MEF后能夠?qū)毎M行基因重組編程，獲得了具有ESCs特性的細胞。這些細胞在細胞形態(tài)、生長特性以及畸胎瘤形成能力等方面，都與ESCs非常相似，并將其命名為iPSCs。2007年Yamanak等[8]和Thomson[9]分別采用相同的基因改造方法將人體細胞重編程為類ESCs，具有與ESCs幾乎一樣的生物學特性，即iPSCs。這些研究成果為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)，開啟了干細胞研究新途徑。

2IPS細胞重編程方法

小鼠與人類iPSCs最初是應用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體[7]和重組慢病毒載體[8]重編程體細胞完成的。其誘導效率當時在所有誘導方法中是最高的，但這兩種誘導系統(tǒng)會將其攜帶的基因整合到宿主細胞基因組中，會增加iPSCs致瘤的可能性。隨著研究深入，研究人員試驗出了一些新的轉(zhuǎn)錄因子導入重編程方法。

2.1外源載體誘導

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體導入外源基因，使獲得的誘導細胞具有較高的致瘤性，在臨床上應用受到了很大的阻礙。Okita等[9]將攜帶有外源基因的普通質(zhì)粒作為載體導入細胞，成功獲得小鼠iPSCs，但此法誘導效率低且誘導所用的時間較長。外源載體誘導DNA重編程也即非病毒載體介導的DNA分子重編程。Woltjen等[10]利用OSMK 組合、2A 序列(自剪切多肽編碼序列)和piggyBac轉(zhuǎn)座子構(gòu)建多順反子載體導入細胞，誘導獲得了iPSCs；同時證明了2A序列之間的重編程因子被完全移除，實現(xiàn)了外源基因沉默。piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)轉(zhuǎn)座頻率和準確率較高，適用范圍更廣，是一個非常有效又比較安全的載體。Jia等[11]利用微環(huán)DNA誘導獲得來源于脂肪干細胞的iPSCs，微環(huán)DNA缺失了細胞分裂的相關(guān)基因，保證了iPSCs的穩(wěn)定性。但這些方法無法完全避免基因重組和插入突變，誘導效率普遍較低。

2.2RNA的誘導方法

有mRNA 誘導和 miRNA 誘導兩種方式。Warren等[12]應用mRNA誘導人多樣細胞類型重編程為干性細胞比當時其他方法更高效，且能使iPSCs更高效分化為終末分化肌細胞。潘傳英等[13]研究發(fā)現(xiàn)Oct4、Sox2、猴病毒40大T抗原的mRNA以一定比例混合后轉(zhuǎn)染靶細胞，誘導因子均能特異性表達并正確定位在細胞核；各誘導因子不僅具有相應的生物學活性而且還協(xié)同作用激活了細胞內(nèi)源性干性標志基因Nanog的表達。這種方法更容易控制外源目的基因在靶細胞中的表達量和表達時間，但是足量的特定mRNA較難獲得。

2.3小分子化合物誘導

Hou等[14]2013年研究表明，小分子化合物能重編程小鼠體細胞為多能干細胞。該方法完全無基因整合，致癌風險低，成為iPSCs研究領(lǐng)域的新趨勢。Hou等利用 7個小分子組合 (VPA、CHIR99021、616452、Tranylcypromine、Froskolin、3-deazaneplanocin A 和 TTNPB)，成功將小鼠體細胞重編程為iPSCs，命名為化學誘導的多潛能干細胞(CiPSCs)。將小鼠CiPSCs注射到8-細胞卵裂球或桑椹胚中獲得了嵌合鼠，其中CiPSCs可以整合到包括性腺在內(nèi)的所有的器官當中，而且可以傳遞給后代，證明其是完全重編程的。這一發(fā)現(xiàn)更有利于深入理解細胞命運決定和轉(zhuǎn)變的機制，在iPSCs研究領(lǐng)域意義重大。

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3一些主要的iPSCs誘導因子

自從2006年Takahashi與Yamanaka等報道重編程小鼠MEF細胞成功獲得iPSCs以來，Oct4、Sox2、Nanog、Lin28等因子是細胞重編程中較為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子。

3.1Oct4

Oct4是Oct家族的同源轉(zhuǎn)錄因子，包括POU區(qū)域在多能干細胞中，ESCs、EG細胞、EC細胞和mGS細胞中表達。Zaehres等[15]研究表明，抑制人和小鼠ESCs中Oct4基因的表達，ESCs就不能維持自我更新，將會分化為滋養(yǎng)層細胞。這表明Oct4在維持ESCs多能性和促進分化上具有很重要的作用。因此，Oct4常常被用于檢測ESCs是否保持未分化狀態(tài)的標志性基因[16]。

3.2Sox2

Sox2是Sox蛋白在ESCs中的表達形式[17]。Masui等[18]研究發(fā)現(xiàn)將小鼠ESCs的Sox2敲除，會導致細胞向滋養(yǎng)外胚層分化。同時發(fā)現(xiàn)導入Sox2或者Oct4的cDNA可以緩解Sox2的敲除產(chǎn)生的影響。表明Sox2和Oct4一樣，對于維持細胞的多能性來說是很重要的，Sox2的作用可能是控制Oct4的表達。

3.3Nanog

Nanog是Chalnbers等[19]2003年在小鼠和人的ESCs中發(fā)現(xiàn)的一類在維持ESCs多能性方面具有強大功能的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子，Nanog缺失的小鼠胚胎不能維持外胚層的多能性。在體外培養(yǎng)的ESCs，終止Nanog的表達導致ESCs的自發(fā)分化。外源的Oct4、Sox2和其他的轉(zhuǎn)錄因子進入體細胞后，可能直接通過相互聯(lián)系的自身調(diào)節(jié)環(huán)路誘導內(nèi)源Oct4、Sox2和Nanog的表達，之后這些因子通過維持自身的表達和激活多能性轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)實現(xiàn)誘導細胞的多能性[20]。顯然Nanog與Sox2和Oct4一起在維持多能性方面發(fā)揮著重要作用。

3.4Lin28

Lin28基因是一種非常保守的RNA連接蛋白，也是一個翻譯加速器或推進器，通過啟動多核糖體mRNA來增加蛋白合成效率，來提高ESCs與iPSCs等多能性干細胞重編程效率[21]。Balzer和Moss[22]認為，Lin28基因還能阻止一種叫做let-7基因的miRNA加工，抑制由于miRNA原因引起的干細胞分化，從而保證干細胞多能性的維持。

近年來，研究者發(fā)現(xiàn)小分子化合物能促進重編程過程，在染色質(zhì)的修飾、信號轉(zhuǎn)導途徑等方面發(fā)揮作用。

3.5組蛋白去乙?；敢种苿?/p>

Huangfu等[23]研究發(fā)現(xiàn)多種影響細胞重編程的化學抑制劑。組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑，如丙戊酸(VPA)，曲古抑菌素A(TSA)和suberoylanilide hydroxami cacid(SAHA)都能顯著地提高重編程效率?；瘜W處理可以作為一種途徑在動力學和效率方面提高重編程?？蓚鞔纳诚导毎惨淹ㄟ^VPA的處理使OSK(Oct4，Sox2，Klf4等轉(zhuǎn)錄因子組合)參與的重編程誘導出的多能性干細胞獲得。因此，VPA的處理和細胞多能性的誘導過程是相一致的。Huangfu等研究表明，在VPA存在時，OSK誘導的原代成纖維細胞重編程的效率提高，比先前研究報道的效率高10～20倍。相關(guān)研究說明在使用VPA處理的情況下，Oct4和Sox2是人成纖維細胞進行重編程所必備的。

3.6天然化合物維生素 C(Vc)

包括成纖維細胞在內(nèi)的體細胞在體外培養(yǎng)時都會發(fā)生細胞衰老現(xiàn)象，部分原因是因為在細胞代謝過程中產(chǎn)生的活性氧(ROS)的聚集。有研究表明，Vc可促進小鼠和人類 iPSCs的產(chǎn)生效率。Vc 促進重編程效率可能在某種程度上是通過降低活性氧的水平而實現(xiàn)的。

此外，還有DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(AZA和5-AzadC)，5-AzadC是AZA的同系物，都是DNA甲基化抑制劑，可通過使特定區(qū)域的基因去甲基化從而激活相關(guān)的基因。細胞分裂素活化蛋白激酶/胞外信號調(diào)節(jié)激酶(MEK)和糖原合成激酶-3信號通路抑制劑，能夠促進ESCs維持自我更新，有助于ESCs的增殖。

4iPSCs鑒定

iPSCs與ESCs相似，從形態(tài)上講一般都生長成集落，集落內(nèi)的細胞小而密集，有較大的細胞核，有1～2個清晰可見的核仁，具有較高的核質(zhì)比[7]。由于iPSCs與ESCs具有相似的特性，可報告特異性關(guān)鍵基因如Nanog和Oct4，鑒定挑選iPSCs[16]。堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)在未分化的多能性細胞中含量大，而分化的多能性細胞不表達或者弱表達AP，多能性細胞維持未分化狀態(tài)檢測的重要指標之一就是AP呈陽性。因此iPSCs應該具有AP活性，經(jīng)AP染色后呈陽性。iPSCs在功能上必須具有分化為具有三個胚層不同組織細胞的能力，采用免疫細胞化學方法檢測不同胚層的特異性抗原，如βⅢ微管蛋白(外胚層)、結(jié)蛋白(中胚層)、α胎兒球蛋白(內(nèi)胚層)等，可以對iPSCs的體外分化特性進行鑒定。產(chǎn)生生殖系嵌合是判斷多能性細胞的一個重要指標，將獲得動物多能性細胞通過顯微操作的方法注射入同物種的桑椹胚或者囊胚中，將注射后的胚胎移植到動物體內(nèi)，產(chǎn)生嵌合體動物，來驗證iPSCs的多能性。體內(nèi)分化實驗即畸胎瘤驗證，iPSCs注射到免疫缺陷小鼠的背部或肌肉組織內(nèi)，經(jīng)過一段時間的生長后可以產(chǎn)生畸胎瘤，通過組織學方法可以檢測是否形成瘤體。iPSCs的鑒定和評價應該根據(jù)研究目的選擇鑒定評價方法，若重演完全的細胞核重編程過程，那么最終得到的細胞要能夠產(chǎn)生嵌合體；若產(chǎn)生有效的干細胞用于藥物開發(fā)等用于人類疾病醫(yī)療，那么最終得到的細胞只要具有自我更新能力并能產(chǎn)生有效的子代就可以。

5iPSCs技術(shù)前景

在羊iPSCs 研究方面，已經(jīng)能完全重編程體細胞為iPSCs，并且生產(chǎn)出了嵌合體羊。Bao等[24]先后獲得了能形成畸胎瘤和擬胚體并具有正常核型的羊iPSCs。 Liu等[25]將綿羊iPSCs注入到二倍體或四倍體胚胎中，形成了內(nèi)細胞團的部分結(jié)構(gòu)，但未形成嵌合體。Sartori等[26]用鼠OSMK誘導綿羊成纖維細胞，產(chǎn)生iPSCs，經(jīng)核型、畸胎瘤和擬胚體鑒定為完全重編程；將獲得的iPSCs移植入胚胎后，生出了嵌合體的小羊。

iPSCs研究經(jīng)過10年的探索，已經(jīng)取得很大進展，但iPSCs的生物安全性和低效率等問題制約著其廣泛應用，這是未來iPSCs研究需要解決的關(guān)鍵問題。若提高iPSCs生產(chǎn)效率，確保其生物安全，將會促進其在轉(zhuǎn)基因動物、優(yōu)質(zhì)動物種質(zhì)資源的保護、瀕危動物保護、再生醫(yī)學等領(lǐng)域的應用，具有廣闊前景。

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Overview of Ovine Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

DOU Xing-tang,LI Wang-bo,WANG Jia-ming,YANG Qiu-feng

(Institute of Animal husbandry of Liaoning province Liaoyang 111000)

Abstract：Somatic cell reprogramming was important way of produced stem cell.Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be generated from somatic cells by ectopic-expression of specific inducing factors，which are capable of maintaining self-renewal and an undifferentiated state just like embryonic stem cells (ESCs).The technique of iPSCs will be close to safe application by used a number of small-molecule compounds aiming at replacing some transcription factors，reprogramming somatic cell and finally succeeding in obtaining iPSCs completely induced by a group of chemicals without any genetic manipulation.Some researchers have obtained iPSCs and also generated chimera of lambs on ovine iPSCs reseach.This review presents a general progress on somatic cell reprogramming，the inducing methods，the inducing factors as well as the research status of identifying iPSCs.

Key words：Ovine；Somatic cell reprogramming；Induced pluripotent stem cells (iPSCs)

中圖分類號：S826.3；S814.8

文獻標識碼：B

文章編號：1005-2739(2016)03-0003-05

作者簡介：豆興堂(1978-)，男，農(nóng)業(yè)推廣碩士，高級畜牧師。主要從事遼寧絨山羊繁殖育種與胚胎工程技術(shù)研究與推廣工作。E-mail：dou791120@sina.com

收稿日期：2016-03-01