裴志勇，張健，尹巧香，楊桂利，趙玉生

(1.北京軍區(qū)總醫(yī)院干部病房一科，北京 100700；2.空軍總醫(yī)院干部病房心內(nèi)科；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所前沿交叉學(xué)科研究室；4.解放軍總醫(yī)院老年心血管病研究所)

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·基礎(chǔ)研究·

地黃低聚糖對過氧化氫-血清饑餓誘導(dǎo)的脂肪組織來源干細胞Bax/Bcl-2表達的影響

裴志勇1，張健1，尹巧香2，楊桂利3，趙玉生4

(1.北京軍區(qū)總醫(yī)院干部病房一科，北京 100700；2.空軍總醫(yī)院干部病房心內(nèi)科；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所前沿交叉學(xué)科研究室；4.解放軍總醫(yī)院老年心血管病研究所)

[摘要]目的探討地黃低聚糖(RGOs)對過氧化氫-血清饑餓誘導(dǎo)的小型豬脂肪組織來源干細胞(ASCs)Bax、Bcl-2表達的影響。方法過氧化氫(200μM)聯(lián)合血清饑餓(H2O2/SD，6 h)建立小型豬ASCs凋亡模型。RGOs(0.01 g/L、0.1 g/L、1 g/L、10 g/L)預(yù)處理12 h并繼續(xù)干預(yù)6 h。Western-blot法測定細胞Bax、Bcl-2的表達。結(jié)果RGOs在一定濃度范圍(0.1 g/L～10 g/L)可以減輕H2O2/SD引起的ASCs損傷，表現(xiàn)在Bax表達下調(diào)，Bcl-2表達上調(diào)。結(jié)論地黃低聚糖對過氧化氫-血清饑餓誘導(dǎo)的脂肪組織來源干細胞的凋亡具有保護作用。

[關(guān)鍵詞]干細胞移植；地黃；細胞凋亡；過氧化氫；Bcl-2相關(guān)X蛋白質(zhì)；模型, 動物

干細胞移植治療急性心肌梗死(AMI)是心血管再生領(lǐng)域研究的新策略，但梗死區(qū)缺血、缺氧造成的惡劣環(huán)境可引起移植干細胞大量凋亡，大大降低了移植效率?？梢?，改善缺血心肌惡劣的微環(huán)境是提高干細胞存活率的關(guān)鍵。地黃低聚糖(RGOs)系從地黃中分離提取的一種多糖成分，具有廣泛的藥理作用，但對于其是否具有抗凋亡作用研究較少。本研究擬采用過氧化氫(H2O2)聯(lián)合血清饑餓(SD)模擬AMI后局部心肌缺血、缺氧的微環(huán)境，誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的小型豬脂肪組織來源干細胞(ASCs)損傷，觀察不同濃度RGOs對ASCs表達Bax、Bcl-2的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物廣西巴馬小香豬，雌雄不拘，體質(zhì)量20～30 kg，由解放軍總醫(yī)院實驗動物中心提供，動物合格證號：SYXK(軍)2007-009。

1.2材料L-DMED培養(yǎng)基、特級胎牛血清(FBS)、Ⅳ型膠原酶、胰蛋白酶(Gibco公司)，Dispase Ⅱ中性蛋白酶(Sigma公司)；30 %過氧化氫溶液(北京化工廠)。兔抗Bax多克隆抗體(Assay designs/stressgen公司)，小鼠抗Bcl-2 單克隆抗體(Santa cruz公司)，硝酸纖維素膜(美國Bio-Rad公司)，BCA蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司)，Kodak BioMax MR X-光片(美國 Kodak)。二氧化碳孵箱(美國 Thermo scientific公司)，普通光學(xué)顯微鏡(德國 Leica DM IL)，倒置相差顯微鏡(日本 Olympus BX51)，低溫離心機(美國 Sigma 3K18)。RGOs以生地黃為原料加工后經(jīng)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所提純，高效液相色譜法檢測RGOs提純物中水蘇糖含量為31.15 %。

1.3方法

1.3.1小型豬ASCs的分離與培養(yǎng)無菌條件下取小型豬腹股溝區(qū)脂肪組織5～8 g，冰PBS沖洗3次，去除血污、筋膜及血管，剪碎呈糊狀；加入20 mL消化液(L-DMEM+0.1%Ⅳ型膠原酶+0.1%Dispase Ⅱ中性蛋白酶+0.1%胰蛋白酶)，置于37℃孵箱振蕩消化40～60 min；加入等量含10% FBS的L-DMEM培養(yǎng)基終止消化，100目、200目篩網(wǎng)過濾，600 g離心6 min；棄上清，加入含10% FBS的L-DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，移入培養(yǎng)皿，置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。24 h后首次換液，隨后每2～3 d換液1次。約1周左右細胞融合80%～90%，加入0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA溶液消化、傳代。倒置顯微鏡觀察原代及傳代的ASCs形態(tài)學(xué)特點。

1.3.3Western-blot測定Bax、Bcl-2的表達RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白，BCA法檢測樣品蛋白濃度，將蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液按1∶4(V∶V) 比例混合，100℃加熱5 min 使蛋白變性。以分離膠濃度為12%的聚丙烯酰胺凝膠進行蛋白電泳，電泳完畢后將蛋白濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束經(jīng)含有5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，雜交洗液TTBS漂洗3次，加入一抗(Bcl-2，1∶200；Bax，1∶200)，4 ℃過夜；次日加入辣根過氧化物酶標記的二抗，以ECL化學(xué)發(fā)光法進行檢測。β-actin 為內(nèi)參對照。

1.3.4Western blot條帶灰度值測定用Gel-Del凝膠成像系統(tǒng)對X-光片進行掃描，計算灰度值(條帶面積×條帶密度)。凋亡蛋白(Bax、Bcl-2)表達以各組灰度值與對照組(Control)灰度值的比值表示。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，多組之間比較先采用F檢驗，后采用q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1小型豬ASCs形態(tài)學(xué)觀察原代細胞接種24 h后首次換液，可見大量貼壁細胞，多呈圓形或橢圓形，少數(shù)呈梭形、三角形或多角形，有粗大突起，核居中，細胞質(zhì)內(nèi)可見大量大小不等透明圓泡及細小顆粒。72 h后，細胞較前伸展變大，形狀如前。7 d左右細胞融合達80 %～90 %，可按1∶3傳代。傳代后的細胞數(shù)小時可完全貼壁，生長較迅速，5 d左右可再次傳代。2～3次傳代后細胞多呈三角形、多角形或星形。

2.2Bax、Bcl-2的表達圖1示各組Bax、Bcl-2表達條帶。各組Bax表達半定量統(tǒng)計分析顯示：單純H2O2/SD組(0 g/L)Bax的表達明顯高于Control組(P<0.01)，給予不同濃度RGOs干預(yù)后，0.01～10 g/L組Bax的表達明顯下降(P<0.05,P<0.01)(圖2)。各組Bcl-2表達半定量統(tǒng)計分析顯示：單純H2O2/SD組Bcl-2的表達明顯低于Control組(P<0.01)，給予不同濃度RGOs干預(yù)后，0.01～10 g/組Bcl-2的表達明顯升高(P<0.05,P<0.01)(圖3)。綜上所述，RGOs可通過下調(diào)Bax的表達，上調(diào)Bcl-2的表達而發(fā)揮抗凋亡作用。

3討論

細胞凋亡受多條信號通路調(diào)控，其中最重要的調(diào)節(jié)因子就是Bcl-2家族，該家族根據(jù)功能不同分為兩類：一類是促凋亡成員如Bax、Bad等，其通過提高線粒體的外膜通透性，增加線粒體中細胞色素C的釋放，激活效應(yīng)caspase，最終導(dǎo)致細胞凋亡；另一類是抗凋亡成員如Bcl-2、Bcl-xl 等，其能夠通過穩(wěn)定線粒體膜阻止細胞色素C 的釋放，從而對線粒體凋亡途徑起負調(diào)控作用[2]。

地黃是一味重要的滋陰補腎中藥，近年來國內(nèi)外學(xué)者對其進行了大量研究，實驗和臨床研究都證實其在免疫、血液及造血、內(nèi)分泌、心血管、神經(jīng)系統(tǒng)等方面具有廣泛的藥理活性。體外研究證實，RGOs具有促進動物骨髓干細胞、骨骼肌成肌細胞及ASCs增殖、分化的功能[3-4]。地黃多糖具有補血、降血糖、抗腫瘤、增強免疫及保護心腦組織避免ATP耗竭和缺血損傷的作用，多位學(xué)者對于地黃及其組分抗氧化損傷的機制也進行了研究。樊淼等[5]研究發(fā)現(xiàn)，地黃寡糖、水蘇糖、梓醇均可改善H2O2所致腦組織的損傷，減少乳酸脫氫酶的漏出。Hu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，梓醇預(yù)處理可以明顯減輕H2O2所致人臍靜脈內(nèi)皮的凋亡，其作用機制與清除氧自由基、激活PI3K/Akt-Bad信號通路，上調(diào)Bcl-2表達及下調(diào)Bax有關(guān)。蔣青等[7]研究發(fā)現(xiàn)，地黃寡糖能夠顯著減少腦缺血再灌注損傷所致的大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡，其作用機制可能是通過調(diào)控Bcl-2/Bax相關(guān)蛋白的表達來實現(xiàn)的。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)[8]，RGOs在一定濃度范圍(0.1～10 g/L)可以減輕H2O2/SD引起的ASCs損傷，表現(xiàn)在細胞活性增加，細胞凋亡率下降。為了進一步明確RGOs抗凋亡的作用機制，我們采用Western-blot法對Bax、Bcl-2的表達進行檢測，結(jié)果顯示，RGOs在一定濃度范圍(0.1～10 g/L)可以減輕H2O2/SD引起的ASCs損傷，表現(xiàn)在Bax表達下調(diào)，Bcl-2表達上調(diào)。提示RGOs可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達發(fā)揮抗凋亡作用。本文僅對RGOs抗氧化應(yīng)激損傷的機制進行了初步探討，具體的作用機制有待進一步深入研究。

(本文圖1～3見插圖1-1)

參考文獻

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[8]裴志勇，趙玉生，高偉，等.地黃低聚糖對過氧化氫-血清饑餓誘導(dǎo)脂肪組織來源干細胞凋亡的影響[J].中國臨床保健雜志，2014,17(5)：519-522.

Effect of Rehmannia glutinosa oligosaccharides on Hydrogen peroxide-and serum deprivation-induced apoptosis in miniswine adipose tissue-derived stem cellsPeiZhiyong*,ZhangJian,YinQiaoxiang，YangGuili,ZhaoYusheng(*DepartmentofGeriatricCardiology,BeijingMilitaryGeneralHospital,Beijing100700,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of Rehmannia glutinosa oligosaccharides (RGOs) on hydrogen peroxide-and serum deprivation-induced apoptosis in adipose tissue-derived stem cells.MethodsAn apoptosis model in miniswine adipose tissue-derived stem cells (ASCs) was established by hydrogen peroxide-and serum deprivation-induced (H2O2/SD,6h)in vitro.RGOs (0.01g/L,0.1g/L,1g/L,10g/L) pretreated for 12 hours and continued presence for 6 hours.Expression of Bax and Bcl-2 was investigated by using Western blot analysis.ResultsRGOs significantly attenuated hydrogen peroxide-and serum deprivation-induced ASCs apoptosis,showing a down-regulated Bax expression and an up-regulated Bcl-2 expression with the concentrations between 0.1g/L-10g/L.ConclutionRehmannia glutinosa oligosaccharides can protect adipose tissue-derived stem cells against hydrogen peroxide-and serum deprivation-induced apoptosis.

[Key words]Stem cell transplantation；Rehmannia glutinosa；Apoptosis；Hydrogen peroxide；Bcl-2-Associated protein;Models, Animal

(收稿日期：2015-12-01)

中圖分類號:R617

文獻標識碼:A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2016.01.023

作者簡介：裴志勇，博士，副主任醫(yī)師，Email:peizy6618222@sina.com

基金項目：國家高科技研究發(fā)展計劃(2006AA02A105)