李小波，劉曼，李培根，王釗，曹學(xué)麗，*，牛曉峰，李雪帆

(1．北京工商大學(xué)食品學(xué)院/食品添加劑與配料北京高校工程研究中心/食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100048;2．太原六味齋實(shí)業(yè)有限公司，山西太原 030006)

山黧豆蛋白質(zhì)的提取及營養(yǎng)價值研究

李小波1，劉曼1，李培根1，王釗1，曹學(xué)麗1，*，牛曉峰2，李雪帆2

(1．北京工商大學(xué)食品學(xué)院/食品添加劑與配料北京高校工程研究中心/食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100048;2．太原六味齋實(shí)業(yè)有限公司，山西太原 030006)

優(yōu)化堿溶酸沉提取山黧豆蛋白的方法，得到山黧豆粗蛋白，并分析其氨基酸組成，同時對山黧豆蛋白質(zhì)進(jìn)行了綜合的營養(yǎng)價值評價。結(jié)果顯示，山黧豆蛋白質(zhì)的較佳提取條件為:提取溫度40℃，pH值10，提取時間1 h，料液比1∶20 g/mL。此條件下，山黧豆蛋白質(zhì)的提取率最高，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)26．1%。山黧豆蛋白的等電點(diǎn)為pH值5;山黧豆蛋白質(zhì)中含有18種蛋白質(zhì)氨基酸，其中谷氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為17．4%，其次是天冬氨酸10．0%。其必需氨基酸占總氨基酸的比值EAA/TAA為42%(＞40%)、必需氨基酸與非必需氨基酸的比值EAA/NEAA為72．41%(＞60%)，即均大于FAO/WHO提出的參考蛋白量。山黧豆蛋白中的氨基酸評分、化學(xué)評分、氨基酸比值系數(shù)以及必需氨基酸比率，除蛋氨酸+胱氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸外，其他均高于WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn);蛋氨酸+胱氨酸、色氨酸分別為第一和第二限制性氨基酸。山黧豆蛋白質(zhì)的必需氨基酸指數(shù)EAAI值為1．16，根據(jù)蛋白質(zhì)的評價標(biāo)準(zhǔn):EAAI值大于0．9為優(yōu)質(zhì)蛋白源，說明山黧豆蛋白質(zhì)屬于優(yōu)質(zhì)蛋白。

山黧豆;蛋白質(zhì);提取;氨基酸分析;營養(yǎng)價值

山黧豆(Lathyrus sativus Linn．)，又名馬牙豆、家山黧豆等，木蘭綱(Magnoliopsida)薔薇亞綱(Rosidae)豆目(Fabales)蝶形花科(Fabaceae)野豌豆族(Trib．Vicieae)山黧豆屬(Lathyrus)，一年生作物［1-2］。由于其具有耐寒、抗旱、抗蟲害、固氮肥沃土壤以及低成本高產(chǎn)的特性，在我國東北、西北、華北等地區(qū)大面積種植［3］。山黧豆籽實(shí)中含有豐富的蛋白質(zhì)和氨基酸，目前大多集中于對其非蛋白質(zhì)氨基酸β-N-草酰-L-α，β-二氨基丙酸(β-ODAP)的研究。β-ODAP是一種具有神經(jīng)毒性的氨基酸，長期食用會造成下肢癱瘓，稱為山黧豆中毒。因此，多數(shù)研究者致力于對β-ODAP的含量測定、分離以及去毒等。但是對于山黧豆蛋白質(zhì)的提取及營養(yǎng)價值研究報道還很少見。鑒于此，本文采用堿溶酸沉法提取山黧豆蛋白質(zhì)，并對溫度、pH值、時間、料液比等提取條件進(jìn)行優(yōu)化，得到山黧豆粗蛋白質(zhì)，然后對其氨基酸組成進(jìn)行分析，綜合EAA/TAA(必需氨基酸/總氨基酸)、EAA/NEAA(必需氨基酸/非必需氨基酸)、AAS(氨基酸評分)、CS(化學(xué)評分)、RC(氨基酸比值系數(shù))、A/E(必需氨基酸比率)、EAAI(必需氨基酸指數(shù))等多項(xiàng)蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值評價指標(biāo)，對山黧豆蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值進(jìn)行了系統(tǒng)評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

主要原料與試劑見表1。

表1 主要原料試劑Tab．1Main raw materials and reagents list

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)儀器見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備Tab．2Main instruments list

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

山黧豆粉碎，過40目篩，放置到冰箱中備用。

1.3.2 山黧豆蛋白等電點(diǎn)的測定

1.3．2.1 考馬斯亮藍(lán)測定蛋白質(zhì)含量的原理

由于蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G250-蛋白質(zhì)產(chǎn)生的復(fù)合物具有高消光效應(yīng)，所以導(dǎo)致了蛋白質(zhì)測定具有高度敏感性。蛋白質(zhì)的疏水微區(qū)與考馬斯亮藍(lán)相結(jié)合后形成的藍(lán)色復(fù)合物，其最大吸收峰在595 nm處，而未發(fā)生反應(yīng)的考馬斯亮藍(lán)G250磷酸溶液成棕紅色，最大吸收峰應(yīng)該在465 nm處。所以在一定的范圍內(nèi)，考馬斯亮藍(lán)與G250-蛋白質(zhì)結(jié)合生成藍(lán)色復(fù)合物后，在595 nm下，吸光度與蛋白質(zhì)含量會呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，故可用于蛋白質(zhì)濃度的測定［4］。

1.3．2.2 山黧豆蛋白等電點(diǎn)的測定

取5份10 g山黧豆粉，加入100 mL蒸餾水，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到10，浸泡、攪拌1 h，4 000 r/min離心20 min，沉渣加水調(diào)節(jié)到pH值為11，再攪拌，離心，將2次離心所得上清液合并。上清液分別調(diào)節(jié)pH值為3．5，4，4．5，5，5．5，分別離心，取0．1 mL上清液，加入0．9 mL水，加入4 mL考馬斯亮藍(lán)(5～20 min之間進(jìn)行比色)測定吸光值，上清液吸光值最小點(diǎn)為山黧豆蛋白的等電點(diǎn)。

1.3.3 山黧豆蛋白提取條件的優(yōu)化

稱取一定質(zhì)量的山黧豆粉，采用一定的料液比(g/mL)、提取時間、提取溫度和堿溶pH值對山黧豆粉進(jìn)行提?。?-7］，調(diào)節(jié)pH值至山黧豆蛋白的等電點(diǎn)pH=5，使蛋白質(zhì)充分析出，4 000 r/min離心20 min，棄去上清液，得到山黧豆的粗蛋白，凍干，稱重。

1.3．3.1 提取溫度的影響

山黧豆蛋白質(zhì)提取條件料液比為1∶10 g/mL、提取時間為1 h、pH值為9，分別設(shè)置溫度為20，30，40，50，60℃，考察提取溫度對山黧豆蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.3．3.2 pH值的影響

保持提取溫度為40℃，料液比1∶10 g/mL，時間1 h，分別調(diào)節(jié)pH值為5，6，7，8，9，考察pH值對山黧豆蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.3．3.3 提取時間的影響

保持體系pH=9、溫度40℃、料液比=1∶10 g/mL，提取時間為0．5，1，1．5，2，2．5 h，考察不同提取時間對山黧豆蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.3．3.4 料液比的影響

提取條件溫度為40℃，pH值為9，提取時間為1．5 h，分別調(diào)節(jié)料液比為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50 g/mL，考察料液比對山黧豆蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.3．3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用正交試驗(yàn)L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)［8-10］，確定山黧豆蛋白質(zhì)的最佳提取條件。試驗(yàn)因素水平表見表3。

1.3.4 山黧豆蛋白質(zhì)的氨基酸組成分析

取凍干的山黧豆粗蛋白粉1 g，加入水解管中，加6 mol/L鹽酸在真空封管后，于(110±1)℃下水解22 h［11］，色氨酸的水解條件為4 mol/L氫氧化鈉溶液，(110±1)℃下真空水解20 h［12］，采用835-50型氨基酸自動分析儀分析山黧豆粗蛋白的18種氨基酸的組成。1.3.5山黧豆蛋白質(zhì)氨基酸營養(yǎng)價值評價

表3 正交試驗(yàn)因素水平表Tab．3Orthogonal experiment table

蛋白質(zhì)氨基酸的營養(yǎng)價值評價方法大概有以下幾種:氨基酸評分(見式(1))、化學(xué)評分(見式(2))、必需氨基酸比率(見式(3))、氨基酸比值系數(shù)(見式(4))、必需氨基酸指數(shù)(見式(5))［13-18］。

式(5)中，a1、a2…an為各種必需氨基酸占必需氨基酸的總量之比;A1、A2…An為雞蛋蛋白質(zhì)中相應(yīng)的必需氨基酸占必需氨基酸總量之比;n為必需氨基酸的種類。

本文采用上述方法對山黧豆氨基酸的營養(yǎng)價值進(jìn)行了評價。

2 結(jié)果與討論

2.1 山黧豆蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定

不同pH值山黧豆蛋白質(zhì)上清液的吸光值見圖1。由圖1可以看出，當(dāng)pH值為5時，吸光度值最小，此時上清液含蛋白質(zhì)量最少，接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，所以確定山黧豆蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為pH=5。因此，以等電點(diǎn)pH=5作為后續(xù)的山黧豆蛋白提取工藝中堿溶后的酸沉pH值條件。

圖1 不同pH值山黧豆蛋白質(zhì)上清液的吸光度Fig．1Absorbance values of Lathyrus sativus Linn．protein supernatant at different pH

2.2 山黧豆蛋白的提取條件優(yōu)化

2.2.1 溫度對山黧豆蛋白質(zhì)提取率的影響

在料液比為1∶10 g/mL、提取時間為1 h、pH值為9的條件下，考察提取溫度對山黧豆蛋白質(zhì)提取率的影響，見圖2。

圖2 溫度對提取率的影響Fig．2Extraction yield of Lathyrus sativus Linn．protein at different temperatures

由圖2可知，在一定的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，山黧豆蛋白質(zhì)的提取率也隨之升高，到40℃時，山黧豆蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到最高，溫度超過40℃，蛋白質(zhì)的提取率有所下降。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的溶出需要一定的溫度，當(dāng)溫度過高，可能由于淀粉的糊化作用使蛋白質(zhì)的提取率降低;溫度過高，還可能造成蛋白質(zhì)的變性，最終影響蛋白質(zhì)的品質(zhì)。因此蛋白質(zhì)的提取溫度設(shè)為40℃較為適宜。

2.2.2 pH值對山黧豆蛋白質(zhì)提取率的影響

保持提取溫度為40℃，料液比1∶10 g/mL，時間1 h，考察pH值對山黧豆蛋白質(zhì)提取率的影響，見圖3。

從圖3可以看出，隨著山黧豆提取液pH值的升高，蛋白質(zhì)的提取率也隨之升高。隨著pH值的升高，植物蛋白的溶解度一般都會隨之增大，但pH值太高會引起蛋白質(zhì)變性，產(chǎn)生一些副產(chǎn)物，如形成有毒的氨基酸，也會降低該蛋白質(zhì)的食用價值。因此選擇pH值為9。

圖3 pH值對提取率的影響Fig．3Extraction yield of Lathyrus sativus Linn．protein at different pH

2.2.3 提取時間對山黧豆蛋白質(zhì)提取率的影響

保持pH=9、溫度40℃、料液比=1∶10 g/mL，考察不同提取時間對山黧豆蛋白質(zhì)提取率的影響，見圖4。

圖4 提取時間對提取率的影響Fig．4Extraction yield of Lathyrus sativus Linn．protein at different extraction time

由圖4可以看出，隨著提取時間的延長，山黧豆蛋白質(zhì)的提取率隨之提高。當(dāng)浸提溫度為1．5 h，山黧豆蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到最高，之后隨著時間的延長提取率下降，原因可能是由于一定的時間后，山黧豆中的淀粉發(fā)生糊化作用，與蛋白質(zhì)結(jié)合，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)難以溶出，所以提取時間選擇在1．5 h。

2.2.4 料液比對山黧豆蛋白質(zhì)提取率的影響

保持溫度為40℃，pH為9，提取時間為1．5 h，考察料液比對山黧豆蛋白質(zhì)提取率的影響，見圖5。

由圖5可以看出，隨著料液比的增大，山黧豆蛋白質(zhì)提取率逐漸升高，料液比為1∶20 g/mL時提取率最大。料液比的增大有利于蛋白質(zhì)的充分溶出，隨著料液比增大，提取上清液濃度降低，在酸沉?xí)r容易造成蛋白質(zhì)不能充分溶出。因此選取1∶20 g/mL為較佳的料液比。

圖5 料液比對提取率的影響Fig．5Extraction yield of Lathyrus sativus Linn．protein at different liquid ratios

2.2.5 山黧豆蛋白質(zhì)提取條件正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

各因素對山黧豆蛋白質(zhì)提取率的影響大小為D＞B＞C＞A，即料液比＞pH值＞時間＞溫度(見表4)，較佳提取條件為A2B3C1D2，確定溫度為40℃，pH值為10，提取時間為1 h，料液比為1∶20 g/mL的提取條件為較優(yōu)組合，此條件山黧豆蛋白質(zhì)的提取率較高，可以達(dá)到26．1%。

2.3 山黧豆蛋白質(zhì)的氨基酸組成分析

對山黧豆蛋白質(zhì)中含有的18種蛋白質(zhì)氨基酸進(jìn)行分析，結(jié)果見表5。氨基酸的總量高達(dá)86．17%，其中含量最高的是谷氨酸，為17．4%，其次是天冬氨酸，為10．0%。谷氨酸在人體內(nèi)通過促進(jìn)氮基丁酸的合成，從而降低血氨，促進(jìn)腦細(xì)胞的呼吸，因此可以用于如精神分裂癥和腦血管障礙等引起的記憶和語言障礙、小兒智力不全等精神疾病的治療［19］。天門冬氨酸作為一種良好的營養(yǎng)增補(bǔ)劑，具有防止和消除疲勞的作用，可用于治療肝臟病、心臟病、高血壓癥［20］。山黧豆蛋白質(zhì)中的8種必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36．19%，而且賴氨酸含量較高，為5．59%。但是賴氨酸一般是其他植物蛋白質(zhì)的第一限制氨基酸，山黧豆可以用于賴氨酸缺乏癥及其伴隨性疾病患者的輔食［21］。

表5 山黧豆蛋白質(zhì)氨基酸成分分析Tab．5Amino acid composition analysis of Lathyrus sativus Linn．proteinmg·g -1

2.4 山黧豆蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值評價

山黧豆蛋白質(zhì)的各種營養(yǎng)評價指標(biāo)見表6。FAO/WHO提出參考蛋白模式為必需氨基酸占總氨基酸的比值EAA/TAA＞40%、必需氨基酸與非必需氨基酸的比值EAA/NEAA＞60%。由表5和表6可知，山黧豆蛋白質(zhì)氨基酸的EAA/TAA=42%，EAA/ NEAA=72．41%，均大于FAO/WHO提出的參考蛋白模式。

對山黧豆中的蛋白質(zhì)進(jìn)行營養(yǎng)學(xué)評價與對比，計(jì)算山黧豆蛋白中的氨基酸評分、化學(xué)評分、氨基酸比值系數(shù)以及必需氨基酸比率。結(jié)果表明，除蛋氨酸+胱氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸外，其他必需氨基酸均高于WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)模式，必需氨基酸評分為54．29，其中蛋氨酸+胱氨酸含量最少，僅為19 mg/g，蘇氨酸次之，質(zhì)量比為29．8 mg/g，而苯丙氨酸+酪氨酸、賴氨酸含量較高。因此，蛋氨酸+胱氨酸、色氨酸分別為第一和第二限制性氨基酸。

EAAI是評價蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值最常用的指標(biāo)，EAAI值越高，說明氨基酸組成越平衡，蛋白質(zhì)的利用率越高。根據(jù)蛋白質(zhì)的評價標(biāo)準(zhǔn):EAAI值大于0．9為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)源，在0．9～0．8為良好蛋白質(zhì)源，在0．8～0．7為可用蛋白質(zhì)源，小于0．7為不宜蛋白質(zhì)源［22］，山黧豆蛋白質(zhì)的EAAI值為1．16，說明山黧豆蛋白質(zhì)屬于優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。

表6 山黧豆蛋白質(zhì)的各種營養(yǎng)評價指標(biāo)Tab．6Nutrition evaluation of Lathyrus sativus Linn．protein

3 結(jié)論

采用堿溶酸沉法，通過對山黧豆蛋白提取方法的優(yōu)化，得到山黧豆粗蛋白，對其氨基酸組成進(jìn)行了分析，對山黧豆蛋白質(zhì)進(jìn)行營養(yǎng)價值綜合評價。結(jié)果表明，山黧豆蛋白質(zhì)的較佳提取條件為提取溫度40℃，pH值10，提取時間1 h，料液比1∶20 g/mL，此條件下山黧豆蛋白質(zhì)的提取率較高，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)26．1%。山黧豆蛋白的等電點(diǎn)為pH=5。

FAO/WHO提出參考蛋白模式為必需氨基酸占總氨基酸的比值EAA/TAA＞40%、必需氨基酸與非必需氨基酸的比值EAA/NEAA＞60%，而山黧豆蛋白質(zhì)氨基酸的EAA/TAA=42%，EAA/NEAA= 72．41%，均大于FAO/WHO提出的參考蛋白模式。

山黧豆蛋白中的氨基酸評分、化學(xué)評分(CS)、氨基酸比值系數(shù)(RC)以及必需氨基酸比率(A/E)，除蛋氨酸+胱氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸外，其他均高于WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)模式;蛋氨酸+胱氨酸、色氨酸分別為第一和第二限制性氨基酸。EAAI是評價蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值最常用的指標(biāo)，EAAI值越高，說明氨基酸組成越平衡，蛋白質(zhì)的利用率越高。山黧豆蛋白質(zhì)的EAAI值為1．16，根據(jù)蛋白質(zhì)的評價標(biāo)準(zhǔn)EAAI值大于0．9為優(yōu)質(zhì)蛋白源，說明山黧豆蛋白質(zhì)屬于優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，值得進(jìn)一步開發(fā)利用。

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Study on Optimization of Extration Process and Nutritional Value of Proteins from Lathyrus sativus Linn．

LI Xiaobo1，LIU Man1，LI Peigen1，WANG Zhao1，CAO Xueli1，*，NIU Xiaofeng2，LI Xuefan2
(1．School of Food and Chemical Engineering/Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients/Beijing Key Lab of Food Quality and Safety，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China; 2．Taiyuan Liuweizhai Industry Co Ltd，Taiyuan 030006，China)

Lathyrus sativus Linn．protein was extracted using the alkaline method and amino acid analysis and comprehensive assessment of nutritional value of protein were investigated．The analysis indicated that the optimized extraction yield of Lathyrus sativus Linn．protein was up to 26．1%under the condition of extraction temperature 40℃，pH 10，time 1 h，and solid-liquid ratio 1∶20 g/mL．The isoelectric point of Lathyrus sativus Linn．protein was pH 5 and 18 amino acids were found．The contents of glutamic acid and aspartic acid were 17．4%and 10．0%．The ratio of essential amino acids to total amino acids(EAA/ TAA)was 42%and the ratio of essential amino acids to non-essential amino acids(EAA/NEAA)was 72．41%which were higher than the reference values proposed by FAO/WHO．Except for methionine+ cystine，threonine，tryptophan，and valine，the contents of other amino acids were higher than WHO/ FAO standard．Meanwhile，methionine+cystine and tryptophan were the first and second limiting amino acids．Moreover，the essential amino acids index(EAAI)of Lathyrus sativus Linn．protein was 1．16，which was higher than 0．9，the criteria for high-quality protein source．Thus，Lathyrus sativus Linn．proteins had high quality．

Lathyrus sativus Linn．;protein;extraction;amino acids analysis;nutritional value

檀彩蓮)

TS214．9;TS201．2;TS207．3

A

10．3969/j．issn．2095-6002．2016．06． 009

2095-6002(2016)06-0046- 07

2015-05- 28

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303069-04)。

李小波，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锓蛛x工程;

*曹學(xué)麗，女，教授，博士，主要從事生物分離和分析方面的研究。

。

李小波，劉曼，李培根，等．山黧豆蛋白質(zhì)的提取及營養(yǎng)價值研究［J］．食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2016，34(6):46-52．

LI Xiaobo，LIU Man，LI Peigen，et al．Study on optimization of extration process and nutritional value of proteins from Lathyrus sativus Linn．［J］．Journal of Food Science and Technology，2016，34(6):46-52．